抗瓜氨酸化肽特異性免疫復(fù)合物對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)滑膜細胞功能影響的研究

高德玉 陳芳芳 劉 陽 王 凱 虞 偉 嚴孝嶺 李曉軍

(南京軍區(qū)南京總醫(yī)院臨床中心實驗科，南京210002)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid arthritis，RA)是一種慢性系統(tǒng)性自身免疫性疾病，病變主要累及外周小關(guān)節(jié)，病變關(guān)節(jié)滑膜組織持續(xù)性增生及炎性細胞浸潤，引起關(guān)節(jié)軟骨和骨的破壞，導(dǎo)致進行性關(guān)節(jié)破壞、畸形，甚至功能喪失。RA的發(fā)病機制并不明確?？构习彼犭目贵w(Anti-citrullinated peptide antibody，ACPA)在RA早期診斷中的高特異性已得到廣泛認同。在RA患者和動物模型中都可發(fā)現(xiàn)關(guān)節(jié)組織內(nèi)有大量Ig、補體及免疫復(fù)合物(Immune complex，IC)的沉積，并可能參與RA關(guān)節(jié)的免疫炎性損傷。目前已發(fā)現(xiàn)在IC中含有的靶抗原有類風(fēng)濕因子(Rheumatoid factor，RF)、Ⅱ型膠原、葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶(GPI)、瓜氨酸化纖維蛋白原、瓜氨酸波形蛋白等［1-3］。

成纖維樣滑膜細胞(Fibroblast-like synoviocyte，F(xiàn)LS)是構(gòu)成滑膜組織的主要細胞成分，能夠應(yīng)答并產(chǎn)生的 IL-15、IL-21、TNF-α、TGF-β、IFN-γ、VIP、iNOS等細胞因子(Cytokines，CK)及酶類，并且能夠上調(diào)COX2和PGE2的表達［4-10］;FLS還能分泌一些促血管生長因子，包括 FGF、VEGF 和 IL-18［7，11，12］，說明FLS在RA血管翳的生成和關(guān)節(jié)炎的進程中都具有促進作用。FLS同樣產(chǎn)生具有白細胞募集能力的趨化因子如 IL-8、GRO-α、MCP-1、MIP-1α、MIP-1β等。這些細胞因子和酶類相互作用直接導(dǎo)致了滑膜增生和軟骨及骨質(zhì)侵蝕，導(dǎo)致骨的破壞。FLS與RA關(guān)節(jié)滑膜炎癥反應(yīng)及骨質(zhì)破壞的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，F(xiàn)LS增殖和分泌異常在RA發(fā)病過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。FLS作為一種效應(yīng)細胞在滑膜組織炎癥中以自分泌和旁分泌的機制經(jīng)細胞因子和趨化因子等效應(yīng)信號刺激或抑制炎癥反應(yīng)，是介導(dǎo)關(guān)節(jié)破壞和滑膜炎癥的主要細胞［13］。

本室前期研究結(jié)果表明(另文發(fā)表)，RA患者血清中存在抗瓜氨酸化肽特異性免疫復(fù)合物(Anticitrullinated peptide antibody specific immune complexes，ACPA-IC)，其水平顯著高于SLE患者及正常對照組，并與血清ACPA含量呈正相關(guān)關(guān)系。為進一步研究RA患者ACPA-IC在RA中的臨床意義和致病作用，本研究在成功培養(yǎng)RA FLS體外模型的基礎(chǔ)上，研究RA患者血清ACPA-IC對體外培養(yǎng)的FLS增殖和分泌細胞因子功能的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標(biāo)本來源 關(guān)節(jié)滑膜組織標(biāo)本取自南京軍區(qū)南京總醫(yī)院骨科行關(guān)節(jié)置換術(shù)或關(guān)節(jié)鏡清除術(shù)的RA患者。選取2008年3月至2009年6月南京軍區(qū)總醫(yī)院及南京鼓樓醫(yī)院的門診和住院處于活動期RA患者血清共90例，男性21例，女性69例，平均年齡(47.4±16.8)歲，RA診斷標(biāo)準依據(jù)美國風(fēng)濕病學(xué)會(American College of Rheumatology，ACR)1987年RA分類標(biāo)準，并除外其它自身免疫性疾病、感染、腫瘤等關(guān)節(jié)相關(guān)疾病，其中血清ACPA陽性患者45例，ACPA陰性患者45例。健康人對照血清獲自本院健康獻血員。RA組和健康對照組年齡、性別無統(tǒng)計學(xué)差異。標(biāo)本收集均獲得醫(yī)院的醫(yī)學(xué)倫理委員會、患者及主管醫(yī)師知情同意。血清分離后貯存于－20℃冰箱備用。

1.1.2 實驗材料 人工合成環(huán)化瓜氨酸肽(Cyclic citrullinated peptide，CCP)，由上海華大天源公司合成，氨基酸序列如下:HQCHQESTXGRSRGRCGRSGS，純度 ＞95%;兔抗 CCP抗體由本實驗室制備［14］;HRP-抗人IgG購自德國歐蒙公司;HiTrap Protein G HP親和層析柱購自美國GE Healthcare公司;CCK-8細胞增殖試劑盒購自日本株式會社同仁化學(xué)研究所;多種CK液態(tài)芯片試劑盒(Milliplex?MAP)購自美國Millpore公司;Luminex xMAP液態(tài)蛋白質(zhì)芯片分析平臺購自美國Luminex公司;聚苯乙烯板購自美國Corning公司;PEG6000購自上海虹光化工廠;胎牛血清(FCS)、Ⅱ型膠原酶和DMEM培養(yǎng)基購自美國Gibco公司;胰蛋白酶購自美國Ameresco公司;核酸蛋白檢測儀購自德國Eppendorf公司;酶聯(lián)儀Model 680購自美國Bio-Rad公司;超凈工作臺購自蘇州安泰設(shè)備廠;CO2培養(yǎng)箱購自德國Heraeus公司。

1.2 方法

1.2.1 FLS培養(yǎng) 參照文獻［15］操作。關(guān)節(jié)滑膜組織用PBS沖洗殘留血跡，充分剪碎后加入8倍體積的2 g/LⅡ型膠原酶，37℃搖床上振搖4～5小時，200目篩網(wǎng)過濾，濾液經(jīng)1 000 r/min離心10分鐘，棄上清液，用含10%FBS的DMEM重懸細胞，置37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中使其貼壁生長，24小時后吸去懸浮的細胞，繼續(xù)培養(yǎng)，每3天換液1次，10～12天傳代一次，取第4～7代FLS進行實驗。

1.2.2 血清IC提取 用HiTrap Protein G HP親和層析法提取血清IC。按說明書步驟進行操作，具體如下:(1)準備收集蛋白的EP管，每管加100 μl 1 mol/L Tris-HCl(pH9.0);(2)G蛋白柱用10 ml上樣緩沖液(20 mmol/L PBS，pH7.0)預(yù)洗柱，速度為1 ml/min;(3)將所要提取標(biāo)本混合，利用0.22 μm濾器過濾去除標(biāo)本中較大顆粒;(4)取血清500 μl，用0.01 mol/L PBS稀釋至1.5 ml，6 000 r/min離心5分鐘，取上清，流穿G蛋白柱，速度為1 ml/min;(5)10 ml上樣緩沖液洗柱，速度為1 ml/min，洗掉未結(jié)合的蛋白，直至流洗液吸光度 A280nm為 0;(6)5 ml洗脫緩沖液(0.1 mol/L甘氨酸-HCl，pH2.7)洗脫 G蛋白柱，收集洗脫液至 EP管中;(7)重復(fù)(4)～(6)操作;(8)將提取蛋白在4℃透析后冷凍干燥，用PBS重新溶解，于4℃保存待用。

1.2.3 ELISA法檢測ACPA-IC

1.2.3.1 PEG沉淀提取血清IC采用PEG6000沉淀法自血清中沉淀 IC。取100 μl血清與100 μl PEG6000(70 g/L)等體積混合，4℃靜置3～4小時，7 000 r/min離心 10分鐘，棄上清，400 μl 0.01 mol/L PBS溶解沉淀，于4℃保存待用。

1.2.3.2 ACPA-IC-ELISA 將兔抗CCP抗體用0.01 mol/L PBS稀釋至10 μg/ml，包被聚苯乙烯板微孔，100 μl/孔，置4℃過夜后用PBST洗板3次，每次1分鐘;每孔加200 μl 10%FCS于4℃封閉過夜，洗板3次后保存于4℃待用。檢測時，取100 μl PEG沉淀物加至反應(yīng)板微孔，置37℃反應(yīng)1小時;洗板3次;加 100 μl HRP-抗人 IgG，37℃ 反應(yīng) 1 小時，洗板3次;加底物顯色液，室溫避光反應(yīng)10分鐘，加終止液終止反應(yīng)后，酶聯(lián)儀檢測各樣本A450nm/630nm值，以樣本A450nm/630nm值－空白孔(PBS替代PEG沉淀物)A450nm/630nm值為測定值。以P/N值≥2.1為結(jié)果陽性。

1.2.4 ACPA-IC刺激對FLS細胞增殖的影響FLS增殖率采用CCK-8試劑檢測。具體步驟如下:(1)將培養(yǎng)瓶中FLS細胞經(jīng)胰酶消化后計數(shù)，調(diào)整細胞懸液濃度為5×104個/ml;(2)細胞接種96孔板(1.5×103個/孔)，實驗設(shè)三個組，RA血清 ACPA-IC、刺激組、健康人血清IC刺激組(對照組)、空白對照組;每個刺激組根據(jù)ACPA-IC濃度分為四個組，即 25、50、75 和100 μg/ml，37℃ CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24小時;(3)培養(yǎng)時間結(jié)束后，每孔加10 μl CCK-8，于37℃ CO2培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)2.5小時，酶標(biāo)儀檢測A450nm/630nm值。

1.2.5 ACPA-IC刺激對FLS分泌CK的影響 實驗分為3組，分別為RA ACPA-IC陽性組［ACPA-IC(+)］、RA ACPA-IC陰性組［ACPA-IC(－)］及健康對照組(C-IC)。將處于對數(shù)生長期的FLS接種于96孔培養(yǎng)板，每孔接種1 500個細胞，分別加入ACPA-IC(+)、ACPA-IC(－)和 C-IC，并使其終濃度分別為25、50和100 μg/ml，并設(shè)定無 IC刺激的 FLS培養(yǎng)對照，培養(yǎng)24小時后，取培養(yǎng)物上清，用液態(tài)芯片法測定CK含量，實驗重復(fù)4次。

1.2.6 液態(tài)芯片法檢測細胞因子濃度 按試劑盒說明書操作，測定培養(yǎng)上清中 IL-1β、IL-2、IL-6、IL-8、IL-10、IL-15、IL-17、TNF-α、GM-CSF、EGF、VEGF等11種CK含量，實驗重復(fù)4次。(1)用200 μl分析液預(yù)處理各孔，室溫下震蕩10分鐘，真空抽濾去除液體;(2)在標(biāo)準品孔、質(zhì)控品孔和樣本孔分別加入標(biāo)準品、質(zhì)控品及分析液各25 μl，之后分別向標(biāo)準品孔和質(zhì)控品孔中加入培養(yǎng)基，在樣本孔中加入相應(yīng)待測標(biāo)本;(3)每孔中加入25 μl微球，4℃過夜;(4)真空抽濾除去孔內(nèi)液體，用200 μl洗滌緩沖液沖洗2次，每孔加入人細胞因子檢測抗體25 μl，室溫下溫育1小時;(5)每孔加入25 μl藻紅蛋白標(biāo)記的鏈霉親合素，置室溫30分鐘。(6)真空抽濾去除液體，并用200 μl洗滌緩沖液洗滌2次，每孔中加入150 μl重懸液。運行l(wèi)uminex操作系統(tǒng)，在luminex平臺上讀取各種細胞因子含量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 用SPSS17.0軟件進行。正態(tài)分布的結(jié)果以x±s表示，用單因素方差分析法對多個樣本進行比較，分析不同組間與濃度間的差異及相關(guān)性，以P＜0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RA患者血清ACPA-IC檢測結(jié)果 90例RA患者和45例健康對照組血清樣本應(yīng)用PEG6000提取IC后進行ACPA-IC檢測，結(jié)果顯示，RA患者血清ACPA-IC水平顯著高于健康對照人群;ACPA+RA患者 ACPA-IC水平高于 ACPA－RA組(P＜0.01)。將獲得的ACPA-IC+RA血清6份、ACPAIC-RA血清4份及正常人血清10份用于后續(xù)實驗。

2.2 IC純化及鑒定 用G蛋白免疫親和層析法從6份ACPA-IC(+)RA血清、4份ACPA-IC(－)RA血清及10份正常人血清中提取IC。將各類純化IC混合后用于后續(xù)實驗。SDS-PAGE鑒定IC的結(jié)果表明，用G蛋白柱免疫親和層析法從血清中可純化出純度較高的IC(圖略)。ACPA-IC(+)RA血清用G蛋白柱純化后的IC，經(jīng)ACPA-IC-ELISA檢測ACPA-IC為陽性，自ACPA-IC(－)RA血清和健康人血清中純化的IC蛋白經(jīng)檢測ACPA-IC均為陰性。

2.3 ACPA-IC刺激對FLS增殖功能的影響 與對照組 IC 相比，四種濃度(25、50、75 和100 μg/ml)的ACPA-IC刺激FLS 24小時后，都能顯著促進FLS的增殖，且均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，其中50 μg/ml濃度的ACPA-IC促FLS增殖作用更為顯著(表1)。

2.4 ACPA-IC刺激對FLS分泌細胞因子的影響分別以25、50和100 μg PEG沉淀物刺激 FLS，培養(yǎng)24 小時后測定細胞上清 IL-1β、IL-2、IL-6、IL-8、IL-10、IL-15、IL-17、TNF-α、GM-CSF、EGF、VEGF 等 11種細胞因子含量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，自RA血清中提取的IC，包括ACPA-IC(+)組和 ACPA-IC(－)組，刺激FLS 24小時后，在細胞上清中可測到大量IL-6、IL-8和GM-CSF分泌，其水平顯著高于來自健康人群的IC刺激組(C-IC)(P≤0.05)(表2～4);其他8種細胞因子如 IL-1β、TNF-α、EGF、VEGF 等含量在三組刺激物間無顯著性差異(表略)。同時還發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)LS在無IC刺激條件下培養(yǎng)后，不分泌GM-CSF、IL-6和IL-8及其他CK。

2.4.1 GM-CSF 不同濃度(25、50、100 μg/ml)的來源于RA血清的ACPA-IC刺激FLS 24小時后，細胞上清可測出大量GM-CSF，其含量明顯高于ACPA-IC(－)和C-IC刺激組(P＜0.05，見表2)，特別是 50 μg/ml和 100 μg/ml組刺激分泌的程度更明顯(P＜0.01)。GM-CSF分泌水平隨著ACPA-IC的濃度的增加而明顯增加，二者之間存在顯著正相關(guān)性(P ＜0.01)。ACPA-IC(－)組僅在100μg/ml劑量組中，出現(xiàn) GM-CSF含量顯著升高趨勢(P＜0.05)但刺激時間對于FLS分泌GM-CSF水平變化并不具有統(tǒng)計學(xué)意義。

表1 ACPA-IC濃度對FLS增殖作用的影響(OD)Tab.1 Proliferation effect of ACPA-IC on FLS(OD)

表2 血清IC刺激FLS后培養(yǎng)上清中GM-CSF水平(pg/ml)Tab.2 Level of GM-CSF after stimulation of IC on FLS(pg/ml)

表3 血清IC刺激FLS后培養(yǎng)基上清中IL-6的濃度(pg/ml)Tab.3 Level of IL-6 after stimulation of IC on FLS(pg/ml)

表4 血清IC刺激FLS后培養(yǎng)基上清中IL-8的水平(pg/ml)Tab.4 Level of IL-8 after stimulation of IC on FLS(pg/ml)

2.4.2 IL-6 用來自RA血清的IC包括ACPA-IC(+)和ACPA-IC(－)刺激 FLS后，細胞分泌 IL-6水平顯著升高，其含量明顯高于C-IC組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，其中ACPA-IC(－)刺激IL-6分泌水平上升幅度要略高于ACPA-IC(+)刺激組。提示ACPA-IC(－)血清中的IC內(nèi)可能含有某種刺激IL-6分泌的物質(zhì)。兩組中IL-6分泌水平均隨著IC濃度的增加而明顯增加，二者之間存在顯著正相關(guān)性(P＜0.05)，但是，隨著刺激時間延長，F(xiàn)LS分泌的IL-6水平變化并不具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.4.3 IL-8 除 25 μg/ml組 外，50 μg/ml和100 μg/ml的ACPA-IC刺激 FLS 24小時后，可誘導(dǎo)細胞分泌大量IL-8，其含量明顯高于同劑量的ACPA-IC(－)和C-IC刺激組(P＜0.01，見表3)。ACPA-IC(－)組IL-8的分泌水平也顯著高于C-IC組(P＜0.05)，但增高程度要遠遠低于ACPA-IC(+)。ACPA-IC(+)和 ACPA-IC(－)組中，IC刺激誘導(dǎo)FLS分泌IL-8的水平與IC的刺激濃度之間呈顯著正相關(guān)性(見表4)。C-IC刺激對GM-CSF分泌水平無顯著影響 (P＞0.05)。但是，隨著刺激時間延長，F(xiàn)LS分泌的IL-8水平變化并不具有統(tǒng)計學(xué)差異。

3 討論

RA是以多關(guān)節(jié)受累為特征的炎癥性疾病，在其發(fā)病過程中，伴隨多種免疫活性細胞如T細胞、B細胞、巨噬細胞、滑膜成纖維細胞(Fibroblast-like synovicyte，F(xiàn)LS)和中性粒細胞等的活化及細胞因子(IL-6、IL-1β、TNF-α、IL-17)、趨化因子和炎性介質(zhì)的釋放。滑膜成纖維細胞不僅可以對炎性介質(zhì)發(fā)生應(yīng)答，本身也可以產(chǎn)生炎性介質(zhì)，是RA炎癥反應(yīng)中重要的驅(qū)動因子［16］?；こ衫w維細胞起源于原始間充質(zhì)干細胞，能夠合成和分泌分泌高水平的細胞因子(如 IL-6、IL-8)、金屬基質(zhì)蛋白酶(MMPs)、前列腺素(PGs)、透明質(zhì)酸酶、組織蛋白酶類等，這些細胞因子和酶類相互作用直接導(dǎo)致了滑膜增生和軟骨及骨質(zhì)侵蝕破壞［13］。血清 IL-6濃度變化不僅與RA的免疫炎癥和骨質(zhì)破壞有關(guān)，而且表達水平的高低還反映了病情活動變化，對RA活動性的判斷也具有一定臨床意義［17］。RA FLS增殖與局部關(guān)節(jié)炎癥和血管翳形成、骨破壞密切相關(guān)，F(xiàn)LS增殖和細胞因子分泌異常在RA發(fā)病過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。Jarvis等［18］通過體外試驗研究發(fā)現(xiàn)，青少年型 RA患者關(guān)節(jié)液中的IC可刺激正常人PBMCs產(chǎn)生前-炎性因子，如 TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8 和 GM-CSF。Schuerwegh等［19］研究發(fā)現(xiàn)，RA患者關(guān)節(jié)液和血清中的IC可促進軟骨細胞的生長、NO的生成和細胞凋亡，提示IC在RA發(fā)病中扮演著重要作用。

本室前期研究發(fā)現(xiàn)，RA患者關(guān)節(jié)液和血清中存在較高水平的抗瓜氨酸化抗體特異性IC(ACPAIC)。正常情況下，抗原抗體復(fù)合物在機體中被吞噬清除，然而在病理狀態(tài)下，IC可誘發(fā)炎癥反應(yīng)。已發(fā)現(xiàn)參與IC形成的抗原有RF、Ⅱ型膠原、瓜氨酸化纖維蛋白原、瓜氨酸化波形蛋白、纖維連接蛋白等［20］，提示針對瓜氨酸化肽特異性的IC存在于RA患者血清及關(guān)節(jié)中，并可能在RA關(guān)節(jié)滑膜組織炎性損傷中發(fā)揮重要作用。

本項研究結(jié)果表明，RA血清ACPA-IC刺激可明顯促進FLS細胞增殖。ACPA-IC刺激FLS后，在細胞培養(yǎng)上清中可測到大量IL-6、IL-8和GM-CSF，其水平顯著高于健康人血清提取的IC刺激組(P≤0.05);但 IL-1β、IL-2、IL-10、IL-15、IL-17、TNF-α、EGF、VEGF等CK含量在各IC組間無顯著性差異。其中50 μg/ml和 100 μg/ml的 ACPA-IC(+)組刺激后，F(xiàn)LS分泌GM-CSF和IL-8量均顯著高于ACPA-IC(－)組和C-IC組，特別是IL-8含量增加的幅度更為明顯，當(dāng)ACPA-IC刺激濃度達50 μg/ml和100 μg/ml時，IL-8分泌水平分別可達 2 490.7和3 748.9 pg/ml，約為ACPA-IC(－)組和正常對照組的20～40倍。ACPA-IC(+)組刺激FLS分泌的IL-6水平也顯著高于正常對照組，但與ACPA-IC(－)組無顯著性差異，提示ACPA陰性的IC中可能含有一些促FLS分泌IL-6的物質(zhì)。ACPA-IC(－)組中，GM-CSF和 IL-8含量僅在刺激劑量為100 μg/ml時，才與正常對照組有顯著性差異。本實驗中還發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)LS在體外無IC刺激條件下培養(yǎng)24小時后，并不分泌GM-CSF、IL-6和 IL-8;C-IC刺激 FLS后，也有少量GM-CSF、IL-6和IL-8分泌，但均要明顯低于ACPA-IC(+)組。說明在健康人血清IC內(nèi)可能也存在某些刺激CK合成與釋放的抗原抗體復(fù)合物。

以上結(jié)果提示，RA患者血清中存在的含ACPA的IC具有更強的促FLS增殖能力，并可刺激FLS分泌更多的GM-CSF、IL-8和IL-6，提示ACPA-IC中含有的瓜氨酸化蛋白或ACPA可能在誘導(dǎo)FLS活化增殖及分泌CK的過程中發(fā)揮重要作用。具體參與促進FLS增殖及分泌CK作用的確切抗原或抗體成分及其作用機制，尚需要進一步深入研究。

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