柚皮苷調(diào)控心肌核因子 NF-κB炎癥信號(hào)通路對(duì)糖尿病心肌病大鼠防治作用①

游 瓊 吳 鏗 涂焰明 李 騰 莫海亮 葉少強(qiáng) 黃瑞娜 梁建光

(廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，湛江524001)

近年來大量研究發(fā)現(xiàn)糖尿病及糖尿病心肌病心肌組織中伴有大量的炎性細(xì)胞浸潤，炎癥因子的異常表達(dá)，提示炎癥反應(yīng)參與了糖尿病心肌病的發(fā)病［1-5］。NF-кB的激活與糖尿病心肌病的發(fā)生及發(fā)展密切相關(guān)，其作為糖尿病心肌病發(fā)病機(jī)制的一個(gè)許多相關(guān)途徑中的中心因子，對(duì)高血糖狀態(tài)下的心肌結(jié)構(gòu)、功能的改變起重要作用，NF-κB激活后可調(diào)控多種炎性因子、細(xì)胞因子(如 TNF-α、IL-6、IL-1β)的表達(dá)，從而參與心肌的炎性損傷［1］。柚皮苷，草藥骨碎補(bǔ)、枳實(shí)和橘紅的主要有效成分，其糖苷配體是 4'，5，7-羥基黃酮，糖基為鼠李糖基 β-1，2-葡萄糖。已作為抗炎、抗病毒、鎮(zhèn)痛、減少血栓廣泛應(yīng)用于臨床，另外還有報(bào)道其具有降血糖、降血脂、降血壓等藥理活性［6］。本課題組前期的實(shí)驗(yàn)研究表明柚皮苷對(duì)糖尿病大鼠的心肌損傷具有明顯的改善作用，其機(jī)制與柚皮苷改善胰島素抵抗、阻斷FFA活化等作用有關(guān)［7］。鑒于NF-кB通路激活誘導(dǎo)的炎性反應(yīng)在糖尿病心肌病發(fā)病中的重要作用，柚皮苷在調(diào)節(jié)心肌糖脂代謝基礎(chǔ)上是否進(jìn)一步抑制了NF-кB的激活以減輕心肌炎性反應(yīng)、阻抑糖尿病心肌病的發(fā)生、發(fā)展呢?值得進(jìn)一步探討研究。

1 材料與方法

1．1 主要材料

1．1．1 動(dòng)物 Wistar大鼠，雄性，體重(160±20)克，SPF級(jí)，合格評(píng)號(hào)SCXK粵2006-0015，由南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。飼養(yǎng)于廣東醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，飼養(yǎng)條件為恒溫(24±2)℃，相對(duì)濕度50% ～70%，飼養(yǎng)環(huán)境符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物環(huán)境設(shè)施要求。

1．1．2 藥物 Naringin粉沫(廣東省梅雁藍(lán)藻公司，純度98%);鏈脲佐菌素(STZ，美國Sigma公司);血糖、胰島素試紙(強(qiáng)生‘中國'醫(yī)療器材有限公司);糖化血清蛋白測試盒(南京建成生物工程研究所);低密度、高密度脂蛋白膽固醇試劑盒、總膽固醇試劑盒、甘油三酯(北京北化康東臨床試劑有限公司);游離脂肪酸測定試劑盒(北京普利萊基因技術(shù)有限公司);生物素標(biāo)記山羊抗兔IgG/小IgG二抗試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司);NF-κB多克隆抗體試劑盒(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)。

1．2 方法

1．2．1 建模 實(shí)驗(yàn)分為正常對(duì)照組(NC組)、模型對(duì)照組(MC組)。NC組一直采用基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng);MC組采用高糖高脂飼料喂養(yǎng)6周誘導(dǎo)大鼠IR狀態(tài)，然后一次性給予腹腔注射1%鏈脲佐菌素30 mg/kg(pH=4.5，4℃配制，隨配隨用)部分破壞胰島β細(xì)胞功能，72小時(shí)后連續(xù)2次空腹血糖 ≥11.1 mmol/L，胰島素敏感指數(shù)降低，且有多飲、多尿、多食現(xiàn)象確定為糖尿病模型，持續(xù)高糖高脂飼料喂養(yǎng)6周。于實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)禁食12小時(shí)，麻醉，腹主動(dòng)脈采血后迅速取出心臟，用生理鹽水制成10%的組織勻漿，檢測相關(guān)指標(biāo)，糖尿病模型組大鼠心肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)異常改變可認(rèn)為DC建模成功［8］。共46只大鼠完成實(shí)驗(yàn)，NC組10只，MC組36只(建模成功率100%，無死亡)。

1．2．2 分組給藥 MC大鼠分為4組:Naringin高、中、低劑量組(NH、NM、NL組)和模型對(duì)照組(MC組)，每組9只。在確定2型糖尿病模型成功后開始給藥，參考 Naringin對(duì) Wistar大鼠系列實(shí)驗(yàn)研究［9-11］，將 NH、NM、NL 組分別設(shè)置為 10、20、40 mg/kg;正常組(NC組)和MC組則予以等體積的蒸餾水。

1．2．3 放射免疫分析外周血炎癥因子 斷尾取血，將3 ml血以3 500 r/min離心10分鐘，取上清－70℃保存，按試劑盒說明書操作分別進(jìn)行放射免疫分析法檢測 TNF-α、IL-6、IL-1β。

1．2．4 免疫組織化學(xué)法測定 取心肌組織切片，常規(guī)脫蠟至水，3%過氧化氫(H2O2)處理清楚內(nèi)源性過氧化物酶。將切片浸入0.01 mol/L，pH=6.0的枸櫞酸緩沖液中，高壓加熱修復(fù)3分鐘后。按試劑盒說明書操作進(jìn)行免疫組織化學(xué)法檢測心肌NF-κB表達(dá)。采用Motic 6.0數(shù)碼醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)測定灰度值及陽性光密度。

1．2．5 心肌組織的形態(tài)學(xué)觀察 動(dòng)物處死后，進(jìn)行組織取材、固定、脫水、透明、浸蠟、石蠟包埋、切片，常規(guī)HE染色，光鏡下觀察心肌細(xì)胞形態(tài)，透射電鏡觀察心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)，每張切片觀察10個(gè)視野。

1．3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)以x±s表示，采用SPSS13．0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所有數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)分布檢驗(yàn)。統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用兩組間的比較采用t檢驗(yàn)，多組間的比較采用One-Way ANOVA分析法，其中兩兩比較用SNK法，并進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 各組大鼠脂糖代謝指標(biāo)比較 與正常對(duì)照組相比，模型對(duì)照組空腹血糖(FBG)、糖化血紅蛋白(HbAlc)、空腹胰島素(FINS)、胰島素敏感指數(shù)(HOMA-IR)以及游離脂肪酸(FFA)、膽固醇(CHOL)、低密度脂蛋白(LDL-C)、甘油三酯(TG)均顯著升高(P＜0.05);而在NH、NM組的糖脂代謝指標(biāo)不同程度降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)果提示，Naringin呈劑量依賴性改善DC糖脂代謝的作用。HOMA－IR=(FBG×FINS)/22.5，見表1。

2．2 各組大鼠心肌形態(tài)學(xué)改變 糖尿病心肌病(DC組)大鼠心肌細(xì)胞和線粒體排列紊亂，肌纖維排列紊亂，心肌細(xì)胞肥大、線粒體腫脹明顯，嵴變寬，細(xì)胞核固縮、裂解;高劑量柚皮苷治療組(HN組)大鼠心肌纖維呈短柱狀，心肌細(xì)胞排列整齊，致密，細(xì)胞核呈橢圓形，線粒體腫脹不明顯，嵴間隙無增寬，排列有序，接近正常，中劑量柚皮苷組(MN組)次之，低劑量柚皮苷干預(yù)組(LN組)無明顯差異，且呈顯著濃度依賴性，見圖1、2。

2．3 各組大鼠NF-κB及其下游炎癥因子改變 糖尿病心肌病(DC組)大鼠心肌NF-κB蛋白及外周血

TNF-α、IL-6、IL-1β分泌增加，不同劑量柚皮苷治療后使其表達(dá)不同程度下降，僅高劑量柚皮苷組(HN組)降低水平有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0．05)，見圖3、表2。

表1 各組大鼠脂糖代謝指標(biāo)(x±s)Tab．1 The comparison of lipid sugar metabolism index in six groups(x±s)

表2 各組大鼠心肌NF-κB的陽性平均光密度以及外周血炎癥因子(x±s)Tab．2 The comparison of myocardium NF-κB positive vascular density and peripheral inflammation factors in six groups(x±s)

圖1 各組大鼠心肌HE染色比較(×400)Fig．1 The comparison of HE staining of myocardiumin different groups(×400)

圖2 各組大鼠心肌超微結(jié)構(gòu)比較(×8 900)Fig．2 The comparison of myocardial cell perspective electron microscope in different groups(×8 900)

圖3 各組大鼠心肌NF-κB蛋白免疫組化比較(×400)Fig．3 The comparison of NF-κB expression of myocardium in different group(×400)

3 討論

基于糖尿病心肌病的“消渴、胸痹”癥狀歸屬于“消渴病心積”范疇。在臨床辯證中，消渴病長期陰虛燥熱、脾虛失運(yùn)、痰濕內(nèi)生、氣陰兩虛、陰損及陽、陰陽兩虛等累及心臟，提示糖尿病心肌病中醫(yī)病機(jī)多屬“氣陰兩虛、痰瘀互結(jié)、心脈痹阻”。根據(jù)中醫(yī)“消補(bǔ)兼施、同治心絡(luò)中痰瘀”的理論，國醫(yī)大師鄧鐵濤方劑中擅用理氣健脾中藥化橘紅治本?。?2］。經(jīng)化橘紅提取分離測定及體外篩選等實(shí)驗(yàn)摸索，我們擬定以其有效成分柚皮苷治療本病。本實(shí)驗(yàn)高糖高脂喂養(yǎng)和一次性腹腔注射低劑量STZ建立的糖尿病心肌病大鼠模型糖脂代謝障礙和心肌形態(tài)學(xué)損傷明顯，而高、中劑量柚皮苷治療6周后明顯改善。該結(jié)果與以往的報(bào)道類似［7，13］。

NF-κB是對(duì)炎癥、免疫調(diào)節(jié)較為敏感的轉(zhuǎn)錄因子，在氧化還原反應(yīng)過程中起著重要作用。高血糖誘導(dǎo)NF-κB通路激活對(duì)心血管的作用機(jī)制具有特異性:如對(duì)微血管，高血糖可引起AGE的形成及蛋白激酶C(PKC)的激活，從而激活NF-κB導(dǎo)致微循環(huán)病變［14］，而在心肌細(xì)胞器，2型糖尿病 NF-κB 的激活，而導(dǎo)致氧化應(yīng)激的增加，并引起心肌線粒體功能障礙及心功能不全［15］。糖尿病狀態(tài)時(shí)，NF-κB活化可產(chǎn)生大量的炎癥介質(zhì)(如 TNF-α、IL-6、IL-1β等)，引起炎癥反應(yīng)的發(fā)生，同時(shí)激活NF-κB信號(hào)通路的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，從而擴(kuò)大心肌局部炎癥損傷。而我們前期研究提示糖尿病心肌病心肌損傷與糖尿病機(jī)體內(nèi)免疫炎癥反應(yīng)密切相關(guān)，而不是單純血糖、血脂升高及心功能不全的直接后果，其作用機(jī)制可能是多方面的因素共同啟動(dòng)宿主劇烈的免疫炎癥應(yīng)答，通過TLR4激動(dòng)后介導(dǎo)NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑引起細(xì)胞功能紊亂［3］。因此，柚皮苷單一改善糖脂代謝障礙并不能完全解析其對(duì)糖尿病心肌病心肌損傷的防治作用，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)步研究提示心肌組織NF-κB蛋白的表達(dá)和外周血TNF-α、IL-6、IL-1β含量增加，觀察到了心肌組織NF-κB途徑的轉(zhuǎn)錄激活，而高、中劑量柚皮苷治療6周明顯抑制了糖尿病心肌病的NF-κB以及其下游細(xì)胞因子的上調(diào)，說明柚皮苷可能呈劑量依賴性阻斷糖尿病心肌病的NF-κB途徑的激活，最終防治心肌形態(tài)學(xué)損傷。

綜上所述，高糖誘導(dǎo)NF-κB信號(hào)通路的級(jí)聯(lián)反應(yīng)參與糖尿病心肌病的發(fā)生發(fā)展過程，柚皮苷呈劑量依賴性對(duì)糖尿病心肌病具有明顯的防治作用，其可能機(jī)制是有效地改善心肌糖脂代謝，下調(diào)了轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的表達(dá)，繼而抑制了NF-κB通路的激活。

1 Lorenzo O，Picatoste B，Ares-Carrasco S et al．Potential role of nuclear factor κB in diabetic cardiomyopathy．［J］Mediators Inflamm，2011;2011:652097．

2 Boudina S，Abel E D．Diabetic cardiomyopathy，causes and effects［J］．Rev Endocr Metab Disord，2010;11(1):31-39．

3 吳 鏗，游 瓊，莫海亮 et al．糖尿病心肌病外周血單核細(xì)胞Toll樣受體4、腫瘤壞死因子-α的表達(dá)及其與心肌灌注的相關(guān)性［J］．中華心血管病雜志，2011;39(6):503-507．

4 Aneja A，Tang W H，Bansilal S et al．Diabetic cardiomyopathy:insights into pathogenesis，diagnostic challenges，and therapeutic options．［J］Am J Med，2008;121(9):748-757．

5 Boudina S，Abel E D．Diabetic cardiomyopathy revisited［J］．Circulation，2007;115(25):3213-3223．

6 游 瓊，吳 鏗．柚皮苷的心血管藥理作用［J］．廣東醫(yī)學(xué)，2010;31(22):3006-3008．

7 吳 鏗，游 瓊，黃瑞娜 et al．柚皮苷能夠通過調(diào)控心肌PPARγ表達(dá)對(duì)糖尿病心肌病大鼠模型心肌損傷起著防治作用［J］．中國藥理學(xué)通報(bào)，2012;28(4):526-530．

8 董世芬，洪 纓，樊江波et al．實(shí)驗(yàn)性2型糖尿病心肌病大鼠模型的建立與評(píng)價(jià)［J］．中國實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)報(bào)，2009;17(4):246-251．

9 Rajadurai M，Stanely Mainzen，Prince P．Preventive effect of naringin on cardiac markers，electrocardiographic patterns and lysosomal hydrolases in normal and isoproterenol-induced myocardial infarction in Wistar rats［J］．Toxicology，2007;230(2-3):178-188．

10 Rajadurai M，Prince P S．Preventive effect of naringin on cardiac mitochondrial enzymes during isoproterenol-induced myocardial infarction in rats:a transmission electron microscopic study［J］．J Biochem Mol Toxicol，2007;21(6):354-361．

11 Rajadurai M，Prince P S．Naringin ameliorates mitochondrial lipid peroxides，antioxidants and lipids in isoproterenol-induced myocardial infarction in Wistar rats ［J］．Phytother Res，2009;23(3):358-362．

12 邱仕君．鄧鐵濤醫(yī)案與研究［M］．北京:人民衛(wèi)生出版社，2009:86-87．

13 梁建光，吳 鏗．柚皮苷對(duì)糖尿病心肌病大鼠心肌超微結(jié)構(gòu)和缺氧誘導(dǎo)因子1α的影響［J］．國際心血管病雜志，2012;39(2):113-117．

14 Picchi A，Capobianco S，Qiu T et al．Coronary microvascular dysfunction in diabetes mellitus:A Review［J］．World J Cardiol，2010;2(11):377-390．

15 Mariappan N，Elks C M，Sriramula S et al．NF-kappaB-induced Oxidative stress contributes to mitochondrial and cardiac dysfunction in type Ⅱ diabetes［J］．Cardiovasc Res，2010;85:473-483．