用酶解法制備殼寡糖及其對(duì)機(jī)體免疫功能的調(diào)節(jié)作用①

張 沛 韓寶芹 陳列歡 彭燕飛 劉萬順 鄭漢東 楊 艷

(中國(guó)海洋大學(xué)海洋生命學(xué)院，青島266003)

殼寡糖(COS)是殼聚糖的降解產(chǎn)物，由2～10個(gè)氨基葡萄糖通過β-1，4-糖苷鍵連接而成。殼寡糖作為自然界中唯一大量存在的堿性氨基寡糖，由于具有分子量低、水溶性好、易吸收等特性，在提高免疫力、抗腫瘤、抗菌、促進(jìn)傷口愈合等方面具有較好的生物學(xué)功能［1，2］。近年來，隨著研究的深入，殼寡糖在免疫方面的研究越來越多，殼寡糖對(duì)免疫系統(tǒng)存在著多元、多效性的調(diào)節(jié)功能［3］。研究表明殼寡糖能夠促進(jìn)巨噬細(xì)胞的增殖和相關(guān)細(xì)胞因子的分泌，進(jìn)而反饋激活巨噬細(xì)胞和其它免疫細(xì)胞，形成網(wǎng)絡(luò)狀的免疫調(diào)節(jié)體系，極大地增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能，抑制荷瘤小鼠腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移［4，5］。殼寡糖對(duì)巨噬細(xì)胞的激活作用在殼寡糖的免疫調(diào)節(jié)、抑制腫瘤功能中發(fā)揮重要作用［6］。殼寡糖能夠促進(jìn)巨噬細(xì)胞釋放一氧化氮，分泌多種細(xì)胞因子［7，8］，如殼寡糖能夠促進(jìn)巨噬細(xì)胞中IL-18的基因轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)，刺激巨噬細(xì)胞分泌 TNF-α 和 IL-1β、IL-18和IL-6［5，9-11］。

殼寡糖對(duì)巨噬細(xì)胞的激活作用是通過巨噬細(xì)胞表面的受體介導(dǎo)的。但是對(duì)于殼寡糖與巨噬細(xì)胞相互作用的分子基礎(chǔ)仍存在不同的結(jié)論。Han等［12］通過激光共聚焦顯微鏡發(fā)現(xiàn)甘露糖受體能夠介導(dǎo)殼寡糖的內(nèi)吞，認(rèn)為殼寡糖誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞釋放TNF-α和Ca2+內(nèi)流的功能主要是通過甘露糖受體介導(dǎo)的。Feng等［10］發(fā)現(xiàn)甘露糖能夠抑制殼寡糖的內(nèi)吞，而LPS和β-葡聚糖則不能抑制殼寡糖的內(nèi)吞。Wu等［13］發(fā)現(xiàn)用TLR4、CD14和CR3的抗體處理巨噬細(xì)胞RAW264.7，能夠阻斷殼寡糖聯(lián)合干擾素誘導(dǎo)的一氧化氮的產(chǎn)生，表明殼寡糖能夠通過結(jié)合巨噬細(xì)胞表面的TLR4、CD14和CR3受體誘導(dǎo)NF-кB的激活和一氧化氮的產(chǎn)生。有關(guān)哪個(gè)受體在介導(dǎo)殼寡糖的內(nèi)吞中發(fā)揮關(guān)鍵受體的作用，殼寡糖進(jìn)入巨噬細(xì)胞進(jìn)而激活巨噬細(xì)胞的分子量范圍是多少，目前還沒有明確的觀點(diǎn)，需要進(jìn)一步深入研究。

本研究利用本實(shí)驗(yàn)室分離的高活性殼聚糖酶，通過酶水解法制備主要成分為3-7單糖聚合度的殼寡糖，將殼寡糖進(jìn)行熒光標(biāo)記，用熒光顯微鏡技術(shù)觀察巨噬細(xì)胞對(duì)殼寡糖的內(nèi)吞作用，進(jìn)而從體外和體內(nèi)兩方面評(píng)價(jià)COS的免疫調(diào)節(jié)功能。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 脂多糖(LPS)(Sigma)，淀粉(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，D-Hank's液體(GEN-ray)，F(xiàn)ITC干粉(青島華晟新澤生物科技有限公司)，MTT干粉(青島華晟新澤生物科技有限公司)，中性紅(上海試劑三廠)，二甲基亞砜(DMSO)(南京化學(xué)試劑有限公司)，小牛血清(HyClone)，DMEM液體培養(yǎng)基(Solarbio Beijing Solarbio Science＆Technology Co.Ltd)，腫瘤壞死因子α酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒(北京愛迪博生物科技有限公司)，IgG、IgM酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒(上海恒遠(yuǎn)生物有限公司)，TLR4單克隆抗體(Cell Signaling)，高活性殼聚糖酶(本實(shí)驗(yàn)室分離純化)。

SPF清潔級(jí)昆明種小白鼠購(gòu)自青島市藥檢所。小鼠雌雄各半，實(shí)驗(yàn)之前在本動(dòng)物房喂養(yǎng)適應(yīng)一周，給予充足的食物和水。

標(biāo)準(zhǔn)規(guī)格的酶標(biāo)儀(RT-2100C，Rayto)，5%CO2、37℃培養(yǎng)箱(HF240，HEAL FORCE)，超凈工作臺(tái)(HEAL FORCE)，倒置熒光顯微鏡(Nikon TS100)，細(xì)胞培養(yǎng)瓶(Costar公司)，96孔培養(yǎng)板(Costar公司)，6孔培養(yǎng)板(Costar公司)等。

1.2 殼寡糖的酶解制備 配置100 ml殼聚糖溶液(濃度1%，調(diào)節(jié)pH為5.5)，于45℃恒溫水浴鍋中保溫10分鐘，然后加入1 ml殼聚糖酶 A溶液(10%)，立即振搖開始反應(yīng)，每隔10分鐘各取反應(yīng)液0.5 ml加入2%NaOH溶液0.2 ml，混勻觀察殘存殼聚糖沉淀產(chǎn)生的狀況。當(dāng)沒有沉淀產(chǎn)生時(shí)加入2%NaOH溶液10 ml終止反應(yīng)。

1.3 殼寡糖成份的鑒定 采用高效液相色譜(HPLC)法分析殼聚糖酶水解產(chǎn)物的組成。高效液相色譜條件如下:使用Waters高效液相色譜儀，檢測(cè)器為301型蒸發(fā)光散色檢測(cè)器。樣品溶液濃度設(shè)置為1%，流動(dòng)相為乙腈/水溶液(75∶25)，柱溫保持在 30℃。進(jìn)樣量為 20 μl，流速 1.0 ml/min。

1.4 殼寡糖的熒光標(biāo)記 殼寡糖的熒光標(biāo)記參照賀繼東的方法進(jìn)行［14］，并加以改進(jìn)，具體方法如下:配制25 ml FITC-無水甲醇溶液(1 mg/ml)，10 ml殼寡糖-水溶液(15%，m/V)，調(diào)節(jié)殼寡糖溶液的pH值為9，加入FITC-甲醇溶液，混勻后室溫、避光反應(yīng)3小時(shí)(殼寡糖與熒光素的質(zhì)量比為60∶1)。反應(yīng)結(jié)束后，使用乙醇沉淀法獲得產(chǎn)品FITC-COS，避光保存。

1.5 FITC-COS與巨噬細(xì)胞的相互作用研究 腹腔注射1%淀粉刺激小鼠3天后，脫頸處死，無菌條件下提取小鼠腹腔巨噬細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為5×104個(gè)/ml，將細(xì)胞懸液接種至48孔板中，置5%CO2、37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4小時(shí)，待細(xì)胞貼壁后吸出上清液，用D-Hank's液洗去未貼壁細(xì)胞，在每個(gè)孔中加入2 ml培養(yǎng)基。培養(yǎng)48小時(shí)后，棄掉每個(gè)孔中的培養(yǎng)基，加入1 ml FITC-COS溶液(1 mg/ml)，孵育不同的時(shí)間(1、5、15分鐘)后，棄去FICT-COS溶液，每孔用PBS沖洗2遍，然后在倒置熒光顯微鏡下觀察，拍照記錄。

為了研究COS與TLR4受體的相互作用，按照上述實(shí)驗(yàn)方法制備腹腔巨噬細(xì)胞，細(xì)胞在加入FITC-COS之前，在孔中加入TLR4單克隆抗體(稀釋比例為1∶10)，37℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育1小時(shí)，然后棄去抗體，加入1 ml FITC-COS溶液(1 mg/ml)，孵育15分鐘后，棄去FICT-COS溶液，用PBS沖洗2遍后在倒置熒光顯微鏡下觀察，拍照記錄。

1.6 殼寡糖對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞(PMφ)功能的影響

1.6.1 MTT法測(cè)COS對(duì)小鼠PMφ增殖的影響小鼠腹腔注射1%淀粉刺激3天后，脫頸處死，無菌條件下提取小鼠腹腔巨噬細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為5×104個(gè)/ml，接種于 96 孔板中，每孔 200 μl，置 5%CO2，37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4小時(shí)，待細(xì)胞貼壁后吸出上清液，用D-Hank's液洗去未貼壁細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)設(shè)6組:對(duì)照組、LPS組(10 ng/ml)、不同濃度的COS 組(10、20、50、100 μg/ml)，每組設(shè)8 個(gè)平行孔。加藥后細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)，在不同的時(shí)間段(24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí))進(jìn)行MTT測(cè)定。

1.6.2 小鼠PMφ吞噬中性紅能力的測(cè)定 小鼠PMφ的制備同1.6.1。實(shí)驗(yàn)分6組:對(duì)照組，LPS組(10 ng/ml)，不同濃度的 COS 組(10、20、50、100 μg/ml)，每組設(shè)8個(gè)平行孔。加藥后細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)后，吸出培養(yǎng)液，每孔加入中性紅200 μl(0.7 mg/ml)，繼續(xù)培養(yǎng)1小時(shí)，棄去培養(yǎng)液，用預(yù)溫生理鹽水液洗滌3遍，用濾紙輕輕吸干液體。每孔加裂解液(0.1 mol/L的冰乙酸與無水乙醇按1∶1體積比混勻)200 μl，4℃過夜。以 D-Hank's液做空白，在492 nm測(cè)定光吸收值。

1.6.3 小鼠PMφ分泌TNF-α因子能力的測(cè)定 小鼠PMφ的制備同1.6.1。實(shí)驗(yàn)分6組:對(duì)照組、LPS組(10 ng/ml)、不同濃度的 COS 組(10、20、50、100 μg/ml)，每組設(shè)8個(gè)平行孔。加藥后細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)后，收集每孔上清培養(yǎng)液，－20℃凍存，待用ELISA試劑盒測(cè)定上清中TNF-α含量。實(shí)驗(yàn)操作按照試劑盒上步驟進(jìn)行。

1.7 殼寡糖對(duì)小鼠體內(nèi)免疫功能的影響 將實(shí)驗(yàn)小鼠分為對(duì)照組、殼寡糖低劑量組(100 mg/kg體重)、中劑量組(250 mg/kg體重)和高劑量組(500 mg/kg體重)，每組小鼠雌雄各半。實(shí)驗(yàn)組小鼠每天灌胃相應(yīng)劑量的殼寡糖，對(duì)照組小鼠灌胃相應(yīng)體積的生理鹽水，分別在相應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)(10、20天)，每組取8只小鼠，摘取小鼠眼球取血，離心(3 000 r/min，15分鐘)分離血清，－20℃凍存，待測(cè)血清中IgG、IgM的含量。小鼠脫頸處死，進(jìn)行解剖，分離胸腺和脾臟組織，用濾紙吸干殘血后，并進(jìn)行稱重(mg)，計(jì)算小鼠胸腺和脾臟指數(shù)。胸腺和脾臟指數(shù)定義為每10克小鼠體重含有的胸腺或脾臟重量(mg/10 g)。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 實(shí)驗(yàn)計(jì)量數(shù)據(jù)表示為x ± s，數(shù)據(jù)處理及分析用SPSS軟件進(jìn)行，用t檢驗(yàn)進(jìn)行數(shù)據(jù)間差異顯著性分析，P＜0.05為差異顯著性水平。

2 結(jié)果

2.1 殼寡糖聚合度分析殼聚糖酶水解產(chǎn)物HPLC分析結(jié)果見圖1，從該圖中可以看出，該酶解產(chǎn)物主要含有聚合度3～7單糖為主的寡糖成分，只含有少量的殼8糖等成分。

圖1 殼聚糖酶水解產(chǎn)物HPLC分析結(jié)果Fig.1 HPLC result of enzyme hydrolysis product of chitosan

圖2 巨噬細(xì)胞對(duì)殼寡糖的內(nèi)吞作用Fig.2 Phagocytosis of chito-oligosaccharides by macrophage

2.2 殼寡糖與巨噬細(xì)胞的相互作用 殼寡糖與巨噬細(xì)胞相互作用的研究結(jié)果見圖2，從圖中可以看出熒光標(biāo)記的殼寡糖可以被巨噬細(xì)胞所吞噬而進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，且隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，巨噬細(xì)胞吞噬殼寡糖的數(shù)量不斷增加，F(xiàn)ITC-COS與巨噬細(xì)胞作用15分鐘后，大量的殼寡糖進(jìn)入到巨噬細(xì)胞中。加入TLR4單克隆抗體對(duì)巨噬細(xì)胞預(yù)處理1小時(shí)后，再加入FITC-COS相互作用15分鐘，巨噬細(xì)胞對(duì)殼寡糖的吞噬被抑制，視野下找不到吞噬寡糖的巨噬細(xì)胞。

圖3 殼寡糖對(duì)小鼠PMφ體外增殖的影響Fig.3 Effects of COS on the proliferation ability of mice PMφ

圖4 不同濃度殼寡糖對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞吞噬中性紅能力的影響(24小時(shí))Fig.4 Effect of COS on the neutral red phagocytosis ability of mice PMφ at different concentrations(24 h)

2.3 COS對(duì)小鼠PMφ增殖的影響 COS對(duì)小鼠原代培養(yǎng)的腹腔巨噬細(xì)胞增殖功能的影響見圖3。從圖中看出不同濃度的殼寡糖刺激小鼠腹腔巨噬細(xì)胞不同時(shí)間后，對(duì)其增殖均沒有顯著影響，即殼寡糖不能促進(jìn)小鼠原代培養(yǎng)PMφ的體外增殖能力。

2.4 COS對(duì)小鼠PMφ吞噬中性紅能力的影響 殼寡糖對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬中性紅能力的影響見圖4。由圖中可以看出，LPS能夠顯著增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬能力，與對(duì)照組相比差異顯著。殼寡糖在不同濃度下(10～100 μg/ml)均能提高細(xì)胞吞噬中性紅的能力，其中濃度為20 μg/ml時(shí)作用效果最佳。

圖5 不同濃度殼寡糖對(duì)小鼠PMφ分泌TNF-α能力的影響(24小時(shí))Fig.5 Effect of COS on TNF-α secretion ability of mice PMφ at different concentrations(24 h)

2.5 COS對(duì)小鼠PMφ分泌TNF-α能力的影響殼寡糖對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞分泌細(xì)胞因子TNF-α能力的影響見圖5。由圖中可以看出，LPS能誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞合成并分泌TNF-α，與對(duì)照組相比差異顯著。殼寡糖在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)能夠刺激小鼠PMφ分泌TNF-α因子，在20 μg/ml時(shí)作用效果最佳。當(dāng)殼寡糖濃度升高到50 μg/ml或者更高時(shí)，殼寡糖對(duì)小鼠PMφ分泌TNF-α因子的作用反而下降。

2.6 殼寡糖對(duì)小鼠血清IgG、IgM含量的影響 小鼠灌胃COS 10天和20天后，對(duì)小鼠血清中IgG、IgM含量影響的結(jié)果見圖6。測(cè)定結(jié)果表明殼寡糖在提高小鼠免疫球蛋白合成方面有較明顯的效果，通過增加體內(nèi)免疫球蛋白的含量，有助于增強(qiáng)機(jī)體免疫力。

對(duì)比兩個(gè)時(shí)間段的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，可以看出隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，高劑量組小鼠體內(nèi)的免疫球蛋白G(IgG)的含量有明顯的提高，與對(duì)照組相比差異顯著，顯示出500 μg/kg體重的殼寡糖能夠有效增強(qiáng)小鼠的免疫功能。小鼠灌胃殼寡糖對(duì)血清中免疫球蛋白M(IgM)含量沒有顯著影響。

圖6 不同劑量殼寡糖對(duì)小鼠血清中IgG和IgM含量的影響(10、20天)Fig.6 Effect of different doses of COS on mice serum IgG and IgM content(10，20 d)

圖7 不同劑量殼寡糖對(duì)小鼠脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)的影響(10、20 天)Fig.7 Effect of different doses of COS onmice thymus and spleen index(10，20 d)

2.7 殼寡糖對(duì)小鼠脾臟、胸腺指數(shù)的影響 小鼠灌胃COS 10天和20天后，對(duì)小鼠脾臟、胸腺指數(shù)影響的結(jié)果見圖7。測(cè)定結(jié)果表明小鼠灌胃殼寡糖能夠顯著增加小鼠脾臟指數(shù)，與對(duì)照組相比差異顯著。但是，小鼠灌胃殼寡糖對(duì)胸腺指數(shù)的影響并不顯著。

3 討論

近年來，隨著研究的深入，殼寡糖因其特有的分子量小、水溶性好、易吸收等性質(zhì)，表現(xiàn)出更好的生理學(xué)功能。殼寡糖在調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能方面的研究越來越多。但是對(duì)于殼聚糖的有效降解，對(duì)于殼寡糖與巨噬細(xì)胞相互作用的分子基礎(chǔ)，以及殼寡糖激活巨噬細(xì)胞后誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，殼寡糖誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞合成細(xì)胞因子的機(jī)制等問題還有待于進(jìn)一步深入研究。

本研究利用本課題組分離得到的高活性殼聚糖酶，通過酶水解的方法制備殼寡糖。該殼聚糖酶活性高，且水解產(chǎn)物以3～7單糖聚合度的寡糖為主要成分，殼聚糖酶水解速度快，降解產(chǎn)物至3～7單糖聚合度時(shí)，酶對(duì)底物不再降解。而傳統(tǒng)的酸、堿降解法制備殼寡糖，降解過程難以控制，產(chǎn)物主要是單糖，難以制備高活性的寡糖成分。該殼聚糖酶降解法是一種快速，可控，環(huán)境無污染的理想制備方法。

殼寡糖對(duì)巨噬細(xì)胞的激活作用是通過巨噬細(xì)胞表面的受體介導(dǎo)的。但是對(duì)于殼寡糖與巨噬細(xì)胞相互作用的分子基礎(chǔ)仍存在不同的結(jié)論。前期研究報(bào)道，甘露糖受體、TLR4、CD14和CR3等受體分子可以介導(dǎo)殼寡糖與巨噬細(xì)胞的結(jié)合［10，12，13］。但是有關(guān)哪個(gè)受體在介導(dǎo)殼寡糖的內(nèi)吞中發(fā)揮關(guān)鍵受體的作用，目前還沒有明確的觀點(diǎn)。近年來，有很多研究發(fā)現(xiàn)多糖的免疫調(diào)節(jié)作用與Toll樣受體有關(guān)。如:桔梗根多糖通過Toll樣受體4(TLR4)激活巨噬細(xì)胞［15］;刺五加多糖通過TLR4激活B細(xì)胞和巨噬細(xì)胞［16］;紅花多糖通過TLR4激活轉(zhuǎn)錄因子NF-кB誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞合成細(xì)胞因子［17］。脂多糖(LPS)可以與巨噬細(xì)胞表面TLR4受體相互作用，誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi) MAPK-NF-кB 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路［18］。Wu［13］也曾報(bào)道過殼寡糖對(duì)巨噬細(xì)胞的激活作用與TLR4受體有關(guān)。本研究將殼寡糖用FITC進(jìn)行熒光標(biāo)記，在熒光顯微鏡下觀察到腹腔巨噬細(xì)胞能夠吞噬FITCCOS，但是細(xì)胞經(jīng)TLR4單克隆抗體預(yù)處理后，細(xì)胞對(duì)殼寡糖的吞噬被完全抑制。結(jié)果表明TLR4在介導(dǎo)巨噬細(xì)胞吞噬殼寡糖進(jìn)而被激活的過程中發(fā)揮關(guān)鍵受體的功能。

在上述研究的基礎(chǔ)上，本文進(jìn)一步研究了酶解制備的殼寡糖的體外、體內(nèi)的免疫調(diào)節(jié)功能。結(jié)果顯示:殼寡糖不能促進(jìn)小鼠PMφ的體外增殖，但是COS能夠顯著提高小鼠PMφ吞噬中性紅能力和分泌TNF-α 因子的能力，20 μg/ml為 COS刺激小鼠PMφ的最佳濃度。體內(nèi)研究結(jié)果表明小鼠灌胃COS，能顯著提高小鼠血清中IgG的含量和小鼠的脾臟指數(shù)，但是對(duì)血清IgM的含量和胸腺指數(shù)沒有顯著影響，這可能是與殼寡糖能夠刺激小鼠的抗體生成能力有關(guān)。脾臟是機(jī)體體液免疫的主要器官，殼寡糖通過增強(qiáng)小鼠的脾臟指數(shù)，誘導(dǎo)體液免疫能力，而胸腺是機(jī)體細(xì)胞免疫的主要器官。殼寡糖對(duì)胸腺指數(shù)影響不顯著。

總之，本研究表明殼寡糖(3-7聚合度)能夠被巨噬細(xì)胞吞噬，進(jìn)而激活巨噬細(xì)胞，具有較好的體外、體內(nèi)免疫調(diào)節(jié)功能，殼寡糖對(duì)巨噬細(xì)胞的激活作用是通過細(xì)胞表面的TLR4受體介導(dǎo)的。本研究為進(jìn)一步研究殼寡糖的生理學(xué)功能、作用機(jī)制和殼寡糖的開發(fā)應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。

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