格爾德霉素對(duì)肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)的膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲能力的影響

王春輝 劉松巖 韓雪梅 (吉林省人民醫(yī)院神經(jīng)外科，吉林 長(zhǎng)春 30000)

膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的腫瘤，侵襲性生長(zhǎng)是其重要的生物學(xué)特性，是外科手術(shù)難以徹底切除和術(shù)后復(fù)發(fā)的主要原因。多年來(lái)，膠質(zhì)瘤侵襲性生長(zhǎng)的發(fā)生機(jī)制一直是研究的熱點(diǎn)。已經(jīng)證實(shí)，肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞侵襲性生長(zhǎng)〔1〕，格爾德霉素(GDM)作為一種抗腫瘤抗生素，對(duì)HGF具有明顯的抑制作用。本研究探討GDM對(duì)HGF誘導(dǎo)的膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲能力的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與細(xì)胞株 HGF購(gòu)自美國(guó)Calbiochem公司，GDM購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，Matrigel膠購(gòu)自美國(guó)BD公司，Transwell小室購(gòu)自美國(guó)Pierce公司。人膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U251-MG和U87-MG由吉林省腫瘤研究所提供，NIH3T3細(xì)胞為吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫教研室提供。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)分組 37℃，5%CO2條件下，用含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)U87和U251細(xì)胞。用終濃度為 30 μg/L的 HGF作用 24 h后，再加入濃度為500 nmol/L的GDM處理48 h，進(jìn)行Transwell實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分為正常對(duì)照(NC)組、HGF組、GDM組和HGF+GDM組。

1.3 條件培養(yǎng)液的制備 運(yùn)用含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)NIH3T3細(xì)胞至細(xì)胞匯合，用無(wú)血清的培養(yǎng)基洗3次。然后加入新鮮無(wú)血清培養(yǎng)基，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h。收集培養(yǎng)上清液過濾，即為含趨化因子的條件培養(yǎng)基，－70℃存儲(chǔ)備用。

1.4 Transwell實(shí)驗(yàn) 取Matrigel膠，用無(wú)血清培養(yǎng)基按1∶3稀釋混勻，以80 μl/孔加至Transwell小室的上室聚碳酸酯膜上(整個(gè)操作在冰上及無(wú)菌條件下進(jìn)行，所有器皿及試管均事先預(yù)冷)。37℃下聚合30 min。將經(jīng)過HGF和GDM預(yù)先處理的細(xì)胞在無(wú)菌超凈臺(tái)內(nèi)用0.25%胰酶消化，PBS洗1次，臺(tái)盼蘭計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)，無(wú)血清的培養(yǎng)基調(diào)細(xì)胞濃度為1.0×106個(gè)/ml，24孔板內(nèi)加入NIH3T3條件培養(yǎng)液，200 μl/孔，將制備好的Transwell小室置于其內(nèi)，上室加入100 μl細(xì)胞懸液，使每孔含有細(xì)胞數(shù)為1.0 ×105個(gè)，于37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)18 h。棄去上室中的培養(yǎng)液，并用生理鹽水棉簽輕輕檫去Matrigel膠，采用0.1%結(jié)晶紫染色，倒置顯微鏡觀察，10×40倍視野下任取5個(gè)不重復(fù)視野照相，并記錄侵襲細(xì)胞數(shù)量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS12.0軟件進(jìn)行方差分析及q檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

與NC組相比，HGF顯著提高了兩種膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲能力(P＜0.05);GDM作用48 h后，U87及U251細(xì)胞穿膜細(xì)胞數(shù)顯著低于NC組及HGF組(P＜0.05);GDM+HGF組兩種膠質(zhì)瘤細(xì)胞穿膜細(xì)胞數(shù)量明顯低于NC組及HGF組(P＜0.05)，接近于GDM組，即GDM抑制了HGF誘導(dǎo)的促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲能力。NC組有較多細(xì)胞穿過Matrigel膠進(jìn)入下室中。HGF組侵入下室細(xì)胞數(shù)量明顯多于NC組。GDM組侵入下室細(xì)胞數(shù)量明顯少于NC組和HGF組。HGF+GDM組侵入下室細(xì)胞數(shù)量明顯少于 NC組及 HGF組，接近于 GDM組。見表1和圖1。

圖1 各組膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲能力比較(×400)

與NC組比較:1)P＜0.05;與HGF組比較:2)P＜0.05

3 討論

膠質(zhì)瘤侵襲性生長(zhǎng)表現(xiàn)為廣泛的局部侵襲而罕見的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，其侵襲方式主要有三種:沿神經(jīng)細(xì)胞、沿血管組織和沿白質(zhì)髓鞘纖維。其侵襲過程涉及多個(gè)步驟:腫瘤細(xì)胞通過細(xì)胞膜表面受體黏附到細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)層黏蛋白上;蛋白水解酶前體的釋放和活化;蛋白水解酶對(duì)ECM，主要是Ⅳ型膠原的水解;瘤細(xì)胞伸出偽足向被降解的基質(zhì)區(qū)域運(yùn)動(dòng)，形成局部侵襲生長(zhǎng)〔2〕。此過程至少兩次與ECM接觸，如缺乏能夠有效降解IV型膠原的酶，則腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移過程難以實(shí)現(xiàn)。因ECM主要是Ⅳ型膠原構(gòu)成，包括基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2和MMP-9與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移關(guān)系最密切〔3～5〕。Sun等〔3〕構(gòu)建了 MMP-9 反義RNA載體，降低了MMP-9的表達(dá)，體外實(shí)驗(yàn)顯示細(xì)胞增殖明顯受到抑制，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)顯示，腫瘤體積、重量、微血管密度和增殖活性均明顯下降。此外，有學(xué)者使用RNA干擾技術(shù)同時(shí)沉默了喉癌HEP-2細(xì)胞株中MMP-2和MMP-9的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)HEP-2細(xì)胞分泌MMP-2和MMP-9能力下降的同時(shí)，出現(xiàn)細(xì)胞生長(zhǎng)受到抑制，侵襲實(shí)驗(yàn)表明其侵襲能力明顯下降〔6〕。關(guān)于HGF與MMP-2關(guān)系，Tsou等〔1〕報(bào)道HGF能夠增加軟骨肉瘤細(xì)胞MMP-2的表達(dá)，并促進(jìn)細(xì)胞轉(zhuǎn)移。選擇性抑制MMP-9的表達(dá)能降低膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲能力〔7〕。此外，因腫瘤的生長(zhǎng)離不開大量的新生血管，而MMP-2和MMP-9能夠通過降解基底膜來(lái)促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移，促進(jìn)新生血管的形成〔2〕，為腫瘤增殖提供條件，提高腫瘤的惡性程度。

已經(jīng)證實(shí)，格爾德霉素或其衍生物17-AAG能抑制MMP-2及MMP-9的分泌和活性〔8〕。課題組前期使用明膠酶譜法測(cè)定U87和U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞MMP-2及MMP-9活性。結(jié)果表明:肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子可顯著增強(qiáng)MMP-2和MMP-9活性;格爾德霉素能夠顯著抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞 MMP-2、MMP-9的活性，并能抑制HGF引起的MMP-2和MMP-9活性增強(qiáng)〔9〕。

本研究表明:HGF可明顯增強(qiáng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲能力，而GDM對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲能力有顯著的抑制作用，并抑制了HGF增強(qiáng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲的能力，可能是通過抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞MMP-2、MMP-9的活性，進(jìn)而抑制了其侵襲。

1 Tsou HK，Chen HT，Hung YH，et al.HGF and c-Met interaction promotes migration in human chondrosarcoma cells〔J〕.PLoS One，2013;8(1):e53974.

2 Groblewska M，Siewko M，Mroczko B，et al.The role of matrix metalloproteinases(MMPs)and their inhibitors(TIMPs)in the development of esophageal cancer〔J〕.Folia Histochem Cytobiol，2012;50(1):12-9.

3 Sun C，Wang Q，Zhou H，et al.Antisense MMP-9 RNA inhibits malignant glioma cell growth in vitro and in vivo〔J〕.Neurosci Bull，2013;29(1):83-93.

4 Mou L，Kang Y，Zhou Y，et al.Neurokinin-1 receptor directly mediates glioma cell migration by up-regulation of matrix metalloproteinase-2(MMP-2)and membrane type 1-matrix metalloproteinase(MT1-MMP)〔J〕.J Biol Chem，2013;288(1):306-18.

5 Kesanakurti D，Chetty C，Rajasekhar Maddirela D，et al.Functional cooperativity by direct interaction between PAK4 and MMP-2 in the regulation of anoikis resistance，migration and invasion in glioma〔J〕.Cell Death Dis，2012;3:e445.

6 孫亞男，楊寶峰，劉 鳴，等.基質(zhì)金屬蛋白酶-2和-9基因同時(shí)沉默抑制喉癌侵襲生長(zhǎng)的實(shí)驗(yàn)研究〔J〕.中華醫(yī)學(xué)雜志，2008;88(1):36-9.

7 Jung JS，Jung K，Kim DH，et al.Selective inhibition of MMP-9 gene expression by mangiferin in PMA-stimulated human astroglioma cells:involvement of PI3K/Akt and MAPK signaling pathways〔J〕.Pharmacol Res，2012;66(1):95-103.

8 Yamamoto Y，Osanai T，Nishizaki F，et al.Matrix metalloprotein-9 activation under cell-to-cell interaction between endothelial cells and monocytes:possible role of hypoxia and tumor necrosis factor-alpha〔J〕.Heart Vessels，2012;27(6):624-33.

9 王春輝，羅毅男，李蘊(yùn)潛，等.格爾德霉素對(duì)HGF誘導(dǎo)的人膠質(zhì)瘤細(xì)胞MMP-2及MMP-9活性的影響〔J〕.中國(guó)老年性雜志，2008;28(1):11-3.