磷酸肌酸后處理聯(lián)合缺血后處理減輕大鼠心肌缺血再灌注損傷

張會(huì)珍 邢艷秋 章 萌 肖 冬 王 慧 寇學(xué)俊

(山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，山東 濟(jì)南 250062)

急性心肌梗死早期溶栓以及后來的PCI作為再灌注治療方法的引進(jìn)，已經(jīng)一定程度上降低了發(fā)病率和死亡率〔1〕。但它致命的缺點(diǎn)就是在再灌注時(shí)由于大量血流的快速恢復(fù)同時(shí)伴有大量自由基等的產(chǎn)生，造成了缺血再灌注損傷，如何更好地提高介入等再灌注的效果，減輕再灌注損傷成為目前研究的方向。缺血后適應(yīng)作為一種創(chuàng)新的治療策略能夠有效地減輕心肌再灌注損傷，但它潛在的缺點(diǎn)是由于再灌注過程中反復(fù)的缺血損害了缺氧ATP的產(chǎn)生〔2〕。磷酸肌酸(Pcr)是一種高能磷酸化和物，Prabhakar等〔3〕研究顯示應(yīng)用外源性Pcr可以提高再灌注心肌內(nèi)的ATP水平。兩者聯(lián)合能不能更好地起到保護(hù)作用及其機(jī)制如何，目前國(guó)內(nèi)外尚未見報(bào)道。本研究探討Pcr后處理聯(lián)合缺血后處理在大鼠缺血再灌注損傷的心肌保護(hù)作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康、雄性、清潔級(jí)Wistar大鼠65只，體重260～290 g，購(gòu)自山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 主要設(shè)備及試劑 小動(dòng)物呼吸機(jī)、離心機(jī)、心電圖機(jī)、酶標(biāo)儀等均由由山東大學(xué)教育部、衛(wèi)生部心血管重構(gòu)與功能研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。伊文思藍(lán)、TTC購(gòu)于美國(guó)Sigma公司。肌酸激酶(CK)、乳酸脫氫酶(LDH)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、髓過氧化物酶(MPO)試劑盒均購(gòu)于南京建成生物工程有限公司。BCA蛋白濃度試劑盒購(gòu)于上海碧云天生物技術(shù)有限公司。Pcr(里爾統(tǒng))購(gòu)于意大利阿爾法韋士曼制藥公司。

1.3 大鼠心肌缺血再灌注模型的建立 方法參照文獻(xiàn)〔4〕。腹腔注射30 mg/kg戊巴比妥鈉麻醉，行氣管切開后連接小動(dòng)物呼吸機(jī)進(jìn)行機(jī)械通氣，分離肌層，沿胸骨左緣切開第3、4肋間，開胸器撐開胸腔，剪開心包，暴露心臟，在左心耳根部下方2 mm處穿入7-0絲線，結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支(LAD)，同時(shí)將一內(nèi)徑1.5 mm的乳膠管至結(jié)扎線和LAD之間，拉緊結(jié)扎線使乳膠管壓迫LAD，造成急性心肌缺血。缺血30 min后，拔出乳膠管，冠狀動(dòng)脈再通，形成再灌注。實(shí)驗(yàn)中以左室前壁發(fā)紺及心電圖標(biāo)、Ⅱ?qū)?lián)ST段抬高為心肌缺血成功標(biāo)志。冠狀動(dòng)脈阻塞之前經(jīng)尾靜脈應(yīng)用300 U/kg肝素鈉抗凝。

1.4 分組及給藥方法 建模過程中死亡5只，成模Wistar大鼠編號(hào)按抽簽法隨機(jī)分為4組(n=10)，均予心肌缺血30 min，再灌注120 min處理:(1)Sham組，冠狀動(dòng)脈只穿線不結(jié)扎;(2)I/R組，缺血30 min后直接再灌注;(3)IPost組，再灌注前給予3次再灌注10 s/缺血10 s處理;(4)Pcr+IPost組，再灌注前5 min尾靜脈緩慢推注Pcr 200 mg/kg，再灌注前同時(shí)予3次再灌注10 s/缺血10 s處理。Sham組、I/R組、IPost組分別給予等量生理鹽水。

1.5 血清CK、LDH、MPO活性測(cè)定 于再灌注2 h末，分離股靜脈取血2 ml，3 000 r/min離心15 min，取上清于 －80℃保存待測(cè)。CK、LDH及MPO活性測(cè)定操作參照試劑盒說明書。

1.6 心肌組織SOD、MDA檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)取缺血區(qū)心肌組織100 mg制成10%組織勻漿，BCA法測(cè)定蛋白濃度，硫代巴比妥酸比色法測(cè)定心肌MDA含量，黃嘌呤氧化酶比色法測(cè)定心肌SOD活性，操作參照試劑盒說明書。

1.7 心肌梗死范圍測(cè)量參照文獻(xiàn)〔5〕實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，原位結(jié)扎冠狀動(dòng)脈，經(jīng)左心室注入1%的Evans藍(lán)2～3 ml，將非缺血心肌染成藍(lán)色，從而顯示出缺血危險(xiǎn)區(qū)(AAR)心肌。10%KCl處死動(dòng)物，立即摘取心臟，以預(yù)冷生理鹽水沖洗殘留血。去除大血管、心房及右心室，－20℃冷凍10 min，沿左心室(LV)長(zhǎng)軸橫切為3～4片厚約2 mm的心肌片，仔細(xì)分離藍(lán)染非缺血區(qū)和無藍(lán)染缺血區(qū)。將無藍(lán)染缺血區(qū)心肌置于1%TTC磷酸緩沖液中，于37℃孵育15 min，此時(shí)壞死區(qū)(AN)呈灰白色，非壞死心肌被染成磚紅色。最后將切片置于10%甲醛中固定15 min，在顯微鏡下仔細(xì)將AN心肌及非梗死AAR心肌分開。將分離好的心肌組織分別稱重，心肌缺血面積以缺血區(qū)心肌重量/左室重量(AAR/LV)來表示，心肌梗死面積以壞死區(qū)心肌重量/缺血區(qū)心肌重量(AN/AAR)來表示。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以±s表示。多組均數(shù)及組間兩兩比較分別采用單因素方差分析和最小顯著差異法(LSD法)。

2 結(jié)果

2.1 各組血清CK、L DH、MPO活性變化 IPost組、Pcr+IPost組較I/R組 CK、LDH、MPO活性顯著降低(P＜0.05);Pcr+IPost組與 IPost組相比，CK、LDH、MPO活性顯著降低(P＜0.05);Pcr+IPost組與 Sham組相比，CK、LDH、MPO活性升高(P＜0.05)。見表1。

表1 各組血清CK、LDH、LDH活性(n=10，±s，U/L)

表1 各組血清CK、LDH、LDH活性(n=10，±s，U/L)

與Sham組比較:1)P＜0.05;與I/R組比較:2)P＜0.05;與IPost組比較:3)P＜0.05;表2同

組別2.85±0.52 1 138±98 81.95±4.13 I/R組 16.42±2.741 5 329.3±344.691 455.80±18.451 IPost組 8.74±1.192) 2 848.5±137.102) 249.32±23.62)Pcr+IPost組 5.79±1.341)2)3)1 830.7±180.511)2)3)147.43±16.961)2)3)CK LDH MPO Sham組

2.2 各組心肌組織MDA、SOD檢測(cè) IPost組、Pcr+IPost組較I/R組MDA顯著降低，SOD顯著增高(P＜0.05);Pcr+IPost組與IPost組相比，MDA顯著降低，SOD顯著增高(P＜0.05);Pcr+IPost組與Sham組相比，MDA升高，SOD降低(P＜0.05)。見表2。

表2 各組心肌組織SOD、MDA(n=10，±s)

表2 各組心肌組織SOD、MDA(n=10，±s)

組別 SOD(U/mgprot) MDA(nmol/mgprot)70.22±7.84 1.37±0.13 I/R組 38.96±3.691 5.65±0.741 IPost組 50.08±3.331)2) 2.95±0.371)2)Pcr+IPost組 64.05±4.171)2)3) 1.82±0.21)2)3)Sham組

2.3 心肌缺血及梗死面積比較 各組大鼠間體重、LV重量均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。假手術(shù)組未見明顯缺血及梗死區(qū)，其余各組間缺血危險(xiǎn)區(qū)面積(AAR/LV)均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。Sham組大鼠心肌梗死面積顯著小于 I/R組、IPost組、Pcr+IPost組(P＜0.05)，IPost組、Pcr+IPost組心肌梗死面積小于I/R組(P＜0.05)，Pcr+IPost組小于 IPost組(P＜0.05)。見表3。

表3 各組心肌梗死面積(n=10，±s)

表3 各組心肌梗死面積(n=10，±s)

與I/R組比較:1)P＜0.05;與IPost組比較:2)P＜0.05

組別 體重(g) LV(g) AAR/LV(%)AN/AAR(%)278.2±3.34 0.79±0.02 43.74±2.13 61±3.88 IPost組 280.8±11.12 0.80±0.05 42.62±1.22 43.27±2.671)Pcr+IPost組 275.2±8.56 0.78±0.03 41.85±1.17 35.52±1.331)2)I/R組

3 討論

缺血后處理作為一種創(chuàng)新的治療策略由Zhao等〔6〕2003年首次提出，通過短暫的再灌注、再阻塞可以使心肌梗死面積降低，降低室性心律失常，改善心功能。本研究在體大鼠的缺血再灌注模型上觀察了缺血后處理可以減少心肌梗死面積，減輕心肌缺血再灌注損傷。缺血后處理使血清CK、LDH活性的降低進(jìn)一步證實(shí)了其縮小心肌梗死面積的作用。

Ten等〔7〕在基因敲除的Pcr缺乏的小鼠動(dòng)物模型中研究發(fā)現(xiàn)，一個(gè)完整的Pcr/Pcr系統(tǒng)在急性應(yīng)激情況下是非常必要的。Pcr對(duì)再灌注心肌的良好保護(hù)作用，它與缺血后處理聯(lián)合起到了協(xié)同效果。

Pcr的心肌保護(hù)作用機(jī)制目前還沒有完全了解，Zhao等〔8〕研究顯示，Pcr對(duì)體外細(xì)胞色素C誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡有抑制作用，國(guó)內(nèi)劉瑛琪等〔9〕也研究發(fā)現(xiàn)應(yīng)用外源性的Pcr可以抑制心肌細(xì)胞凋亡，阻止線粒體跨膜電位的下降，間接的提示抑制線粒體膜通透轉(zhuǎn)換孔的開放，具體抑制其開放的機(jī)制目前還不是很清楚。本研究顯示缺血后處理可以減低大鼠心肌SOD的活性，提高M(jìn)DDA的活性，在此基礎(chǔ)上加用外源性Pcr可以進(jìn)一步降低心肌SOD的水平，提高M(jìn)DA的水平，而SOD是體內(nèi)氧化代謝過程中產(chǎn)生的超氧陰離子自由基清除劑，其活力的高低能反映機(jī)體抗氧化防御水平，SOD活力下降可導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化的最終產(chǎn)物MDA含量升高，因MDA是一個(gè)穩(wěn)定的脂質(zhì)過氧化物，它的高低可反映脂質(zhì)過氧化程度，由此可以推測(cè)應(yīng)用外源性Pcr有意義地抑制了氧自由基的產(chǎn)生，提供了對(duì)細(xì)胞和細(xì)胞器膜的抗氧化保護(hù)作用。因線粒體膜通透轉(zhuǎn)換孔的開放與鈣離子、氧自由基、中性pH值的快速恢復(fù)和ATP的耗竭密切相關(guān)〔10〕。由此推測(cè)Pcr可能通過抑制氧自由基的產(chǎn)生和脂質(zhì)過氧化保護(hù)心肌線粒體，阻止線粒體膜通透轉(zhuǎn)換孔的長(zhǎng)時(shí)間開放，它與缺血后處理聯(lián)合發(fā)揮了很好的協(xié)同作用。

MPO作為中性粒細(xì)胞嗜天青顆粒中主要存在的酶，它的高低可反映中性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)程度。本研究顯示，再灌注心肌血清MPO活性明顯升高，經(jīng)過缺血后處理該指標(biāo)明顯下降，顯示了缺血后處理抑制炎癥反應(yīng)的作用，加用外源性Pcr后MPO又進(jìn)一步明顯下降，由此推測(cè)Pcr在再灌注心肌的保護(hù)作用可能與抑制中性粒細(xì)胞的聚集，從而減輕炎癥反應(yīng)，從而減輕了心肌組織的壞死。

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