不同制備工藝消瘤平糖漿劑對小鼠免疫功能的影響

李燦，吳倩，曹軍華

（襄陽市中心醫(yī)院，湖北 襄陽 441021）

不同制備工藝消瘤平糖漿劑對小鼠免疫功能的影響

李燦，吳倩，曹軍華

（襄陽市中心醫(yī)院，湖北 襄陽 441021）

目的：研究不同工藝制備的消瘤平糖漿劑對小鼠免疫功能影響。方法：用不同體積分?jǐn)?shù)乙醇將小柴胡湯進(jìn)行分級沉淀，分別加入華蟾素和氟尿嘧啶制成消瘤平－Ⅰ、消瘤平－Ⅱ、消瘤平－Ⅲ、消瘤平－Ⅳ4種糖漿劑，采用MTT法檢測其對脾淋巴細(xì)胞增殖情況，中性紅法測腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能。結(jié)果：消瘤平－Ⅰ、消瘤平－Ⅱ、消瘤平－Ⅲ均能促進(jìn)脾淋巴細(xì)胞增殖和腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能的作用，且具有一定的量效關(guān)系。結(jié)論：所制備的4種糖漿劑中消瘤平－Ⅰ提高小鼠免疫功能效果最好。

制備工藝；消瘤平；免疫；淋巴細(xì)胞；巨噬細(xì)胞

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)證實(shí)，腫瘤的發(fā)生、發(fā)展以及復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移與機(jī)體的免疫功能紊亂或失衡，特別是抗腫瘤能力低下有關(guān)［1］。中藥治療惡性腫瘤，通過扶正祛邪，可增強(qiáng)機(jī)體免疫功能，能減輕患者用化療藥后的臨床癥狀，提高患者術(shù)后生存質(zhì)量，有較明確的抗復(fù)發(fā)效果。本文將中成藥和化學(xué)藥制成復(fù)方制劑，以提高荷瘤小鼠的免疫功能為指標(biāo)來篩選消瘤平的制備工藝?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料

1.1 儀器 R206旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海申升科技有限公司）；TDL－5低速大容量離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；DZF－6260型真空干燥箱（上海市精宏試驗(yàn)設(shè)備有限公司）；ELx800型酶聯(lián)免疫檢測儀（BIO－TEK公司）。

1.2 藥物及試劑 柴胡，炙甘草，黃芩，大棗，法半夏，黨參等由深圳市三九現(xiàn)代中藥有限公司提供；華蟾素（安徽金蟾生化股份有限公司，批號100907－2）；氟尿嘧啶（天津金耀氨基酸有限公司，批號101125）；RPMI 1640培養(yǎng)基（Gbico公司）；刀豆蛋白A和MTT（Sigma公司）；超純水為自制；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 實(shí)驗(yàn)動物 ICR小鼠150只，6周齡左右，（20±2）g，雌雄兼用，由湖北文理學(xué)院醫(yī)學(xué)院動物實(shí)驗(yàn)中心提供，合格證號：襄醫(yī)動字第2001001號。

2 方法

2.1 消瘤平糖漿劑的制備 工藝流程如下：

圖1 消瘤平的工藝流程Fig 1 Technological process

采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀提取消瘤平，HPLC測得消瘤平Ⅰ－Ⅳ中黃芪苷含量分別為1.97，2.12，2.32，2.37 mg·mL－1。

2.2 動物分組、模型制備及給藥 按文獻(xiàn)［2］方法制備H22模型小鼠，接種24 h后，隨機(jī)分為荷瘤對照組、陽性對照組及消瘤平Ⅰ～Ⅳ各3個劑量組，每組10只。正常對照組和荷瘤對照組灌胃生理鹽水0.2 mL·d－1；陽 性 對 照 組 腹 腔 注 射 5－Fu 25 mg·kg－1·d－1；消瘤平 Ⅰ－Ⅳ 3 個劑量組分別按照12.5、25、50 mg·kg－1·d－1灌胃，皆連續(xù)給藥10 d。

2.3 淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)的測定 停藥次日在超凈工作臺無菌取出小鼠脾臟，制備各組的脾細(xì)胞懸液，用含10%小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1×107/mL。ConA（或LPS）作為刺激源在體外培養(yǎng)48 h，MTT測定細(xì)胞增殖反應(yīng)。用酶標(biāo)儀于570 nm處測定各孔的OD值。

2.4 中性紅法測定腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能 末次給藥24 h后，頸椎脫臼處死小鼠，無菌收集小鼠腹腔液，1 000 r·min－1離心，Hanks液洗滌細(xì)胞3次，1640培養(yǎng)液制備細(xì)胞懸液。取3 mL置培養(yǎng)皿中，37℃，5%CO2培養(yǎng)2 h，巨噬細(xì)胞黏附于容器表面，用4℃Hanks液吹吸，收集黏附細(xì)胞，血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)并調(diào)整細(xì)胞密度為2×109個/L－1，置37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 h后，棄上清和非貼壁細(xì)胞。取貼壁巨噬細(xì)胞，加0.1%中性紅生理鹽水，37℃繼續(xù)培養(yǎng)30 min，棄中性紅，用37℃PBS反復(fù)沖洗巨噬細(xì)胞，用體積分?jǐn)?shù)50%醋酸和50%乙醇稀釋后，測OD值。2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 本實(shí)驗(yàn)所用數(shù)據(jù)采用office 2007、SPSS15.0整理、統(tǒng)計(jì)、分析。計(jì)量資料以±s表示，組間比較采用dunnett檢驗(yàn)。

3 結(jié)果

3.1 不同制備工藝的消瘤平對荷瘤小鼠T、B淋巴細(xì)胞增殖的影響 模型組小鼠T、B淋巴細(xì)胞增殖明顯受到抑制；5－Fu（25 mg·kg－1）腹腔注射給藥使T、B淋巴細(xì)胞增殖水平更加低下；給藥組除消瘤平－Ⅳ外，其余3種均能促進(jìn)T、B淋巴細(xì)胞的增殖，且具有濃度依賴性，與模型組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01），其中以消瘤平－Ⅰ免疫活性最強(qiáng)，結(jié)果見表1。

3.2 不同制備工藝的消瘤平對腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響 與正常對照組相比，模型組小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能顯著下降（P＜0.001）；5－Fu（25 mg·kg－1）腹腔注射給藥使巨噬細(xì)胞吞噬功能更加低下；灌胃給予消瘤平－Ⅰ和Ⅱ后，小鼠的腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能呈劑量依耐性升高，與模型組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01，P＜0.05，P＜0.001），消瘤平－Ⅲ中、高劑量也能顯著促進(jìn)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能（P＜0.05，P＜0.01），其中以消瘤平－Ⅰ免疫活性最強(qiáng)。見表2。

表1 不同制備工藝消瘤平對荷瘤小鼠T、B淋巴細(xì)胞增殖的影響（±s，n＝6）Tab 1 Influence of different preparation technologies of Xiaoliuping on T，B lymphocyte proliferation in tumor－bearing mice（±s，n＝6）

表1 不同制備工藝消瘤平對荷瘤小鼠T、B淋巴細(xì)胞增殖的影響（±s，n＝6）Tab 1 Influence of different preparation technologies of Xiaoliuping on T，B lymphocyte proliferation in tumor－bearing mice（±s，n＝6）

注：與正常對照組比較，aP＜0.01，bP＜0.001；與CTX組比較，cP＜0.05，dP＜0.01

組別 劑量/mg·kg－1 T細(xì)胞OD值 B細(xì)胞OD值對照組 － 0.570±0.065 0.558±0.033 040模型組 － 0.363±0.031a0.348±0.030b 5－Fu 25 0.354±0.031 0.344±0.032消瘤平－Ⅰ 12.5 0.417±0.006c 0.412±0.009d消瘤平－Ⅰ 25 0.428±0.004d 0.420±0.013d消瘤平－Ⅰ 50 0.454±0.006d 0.434±0.015d消瘤平－Ⅱ 12.5 0.416±0.014c 0.403±0.030c消瘤平－Ⅱ 25 0.420±0.017c 0.415±0.020c消瘤平－Ⅱ 50 0.436±0.016d 0.419±0.004d消瘤平－Ⅲ 12.5 0.408±0.016c 0.406±0.014c消瘤平－Ⅲ 25 0.418±0.018c 0.403±0.017c消瘤平－Ⅲ 50 0.429±0.018c 0.414±0.014d消瘤平－Ⅳ 12.5 0.343±0.030 0.393±0.044消瘤平－Ⅳ 25 0.365±0.030 0.395±0.043消瘤平－Ⅳ 50 0.379±0.037 0.401±0.

表2 不同制備工藝消瘤平對荷瘤小鼠巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響（±s，n＝6）Tab 2 Influence of different preparation technologies of Xiaoliuping on macrophage phagocytosis in tumor－bearing mice（±s，n＝6）

表2 不同制備工藝消瘤平對荷瘤小鼠巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響（±s，n＝6）Tab 2 Influence of different preparation technologies of Xiaoliuping on macrophage phagocytosis in tumor－bearing mice（±s，n＝6）

注：與對照組比較，aP＜0.001；與 CTX 組比較，bP＜0.05，cP＜0.01，dP＜0.001

組別 劑量/mg·kg－1 巨噬細(xì)胞OD值對照組 － 0.840±0.079 046模型組 － 0.505±0.011a 5－Fu 25 0.485±0.032消瘤平－Ⅰ 12.5 0.628±0.073b消瘤平－Ⅰ 25 0.650±0.095b消瘤平－Ⅰ 50 0.685±0.047d消瘤平－Ⅱ 12.5 0.609±0.030c消瘤平－Ⅱ 25 0.629±0.086b消瘤平－Ⅱ 50 0.630±0.089b消瘤平－Ⅲ 12.5 0.599±0.096消瘤平－Ⅲ 25 0.637±0.040c消瘤平－Ⅲ 50 0.626±0.088b消瘤平－Ⅳ 12.5 0.530±0.028消瘤平－Ⅳ 25 0.550±0.041消瘤平－Ⅳ 50 0.587±0.

4 討論

消瘤平糖漿劑是小柴胡湯加上華蟾素和氟尿嘧啶組成。小柴胡湯是中醫(yī)和解少陽的著名代表方劑，由柴胡、炙甘草、黃芪、大棗、法半夏、黨參6味中藥組成［3］。中成藥和化學(xué)藥所屬不同體系，但其治病的目的是一樣的。某些化學(xué)藥治療作用明顯但不良反應(yīng)大，與中藥配伍后，在提高療效的同時還能減輕不良反應(yīng)。腫瘤患者接受化療后常出現(xiàn)燥熱傷津所致的陰虛內(nèi)熱或氣陰兩虛，治以滋陰潤燥清熱或益氣養(yǎng)陰中藥而取效。氟尿嘧啶是抗腫瘤化療藥，常產(chǎn)生嘔吐、惡心等胃腸道不良反應(yīng)；小柴胡和解少陽，疏肝利膽，通達(dá)表里；黃芪、黨參為補(bǔ)中益氣藥，能調(diào)整胃腸功能；炙甘草補(bǔ)脾和胃，用于脾胃虛弱，并提高免疫功能；小柴胡湯聯(lián)合華蟾素和氟尿嘧啶可提高抗腫瘤療效，并減少化療的不良反應(yīng)。近年小柴胡湯調(diào)節(jié)免疫、抗腫瘤作用以及對神經(jīng)－內(nèi)分泌－免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)作用越來越受到更多學(xué)者的重視［4－5］。

本文用不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇將消瘤平水提液進(jìn)行分級沉淀、分離純化，去除醇溶性物質(zhì)，得到各級沉淀物。所得沉淀部分分別加水溶解后再加入華蟾素和化學(xué)藥氟尿嘧啶制成糖漿劑，采用單核細(xì)胞直接細(xì)胞毒性測定法檢測其對荷瘤小鼠脾細(xì)胞增殖反應(yīng)的影響，以及中性紅法測定腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能，以提高荷瘤小鼠免疫活性為指標(biāo)優(yōu)選消瘤平糖漿劑的制備工藝。在水提醇沉法中，醇沉濃度是比較關(guān)鍵的因素，影響消瘤平的得率及含量。對首烏藤多糖［6］的研究證明，乙醇在55%～85%之間，其得率與醇沉濃度幾乎呈正相關(guān)，80%醇沉濃度時得率和含量均達(dá)到最高，與相關(guān)報(bào)道一致。

免疫系統(tǒng)作為一個完整的、自主的系統(tǒng)在維護(hù)和調(diào)整生命活動中起著重要作用，免疫功能失調(diào)可加速機(jī)體正常細(xì)胞的癌變。惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展與機(jī)體免疫功能狀況關(guān)系密切［7］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，消瘤平－Ⅰ、消瘤平－Ⅱ和消瘤平－Ⅲ均能明顯提高荷瘤小鼠淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)、腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能，其中以消瘤平－Ⅰ的效果最好。由此推斷，消瘤平可以促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖，提高機(jī)體非特異性細(xì)胞免疫和免疫調(diào)節(jié)功能，起到抗腫瘤作用，其中黃芪苷含量最低的消瘤平－Ⅰ免疫活性最強(qiáng)，由此可見，藥理活性和含量并不成正相關(guān)，可能與其中所含成分有關(guān)，這還有待進(jìn)一步研究。

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Influence of Xiaoliuping syrup produced by different preparation technologies on immune function in mice

LI Can，WU Qian，CAO Jun－h(huán)ua
（Xiangyang Central Hospital，Hubei Xiangyang 441021，China）

OBJECTIVETo study the influence of Xiaoliuping syrup produced by different preparation technologies on immune function in mice.METHODSWater extracts of Xiao Chaihu decoction underweng fractional precipitation by ethanol of different concentrations.Cinobufagin and fluorouracil were added and produced Xiaoliuping－Ⅰ，Xiaoliuping－II，Xiaoliuping－III and Xiaoliuping－IV respectively.MTT assay was used to detect the proliferation of spleen lymphocytes.Phagocytosis of peritoneal macrophages was tested by neutral red test.RESULTSXiaoliuping－Ⅰ，Xiaoliuping－Ⅱand Xiaoliuping－Ⅲall were able to promote the proliferation of spleen lymphocytes and phagocytosis of peritoneal macrophages，the dose－effect relationship existed.CONCLUSIONXiaoliuping－Ⅰbest the improved immune function in mice best.

preparation technology；Xiaoliuping；immune；lymphocyte；macrophages

R969

A

1001－5213（2013）01－0032－03

李燦，男，主管藥師，電話：13907278660，E－mail：lican1978＠126.com

曹軍華，男，主管藥師，E－mail：iamforever＠sina.com

2012－07－22