檸檬酸和EDTA對銅污染土壤環(huán)境中吊蘭生長的影響

汪楠楠，胡 珊，吳 丹，王友保，2，*

(1．安徽師范大學生命科學學院，蕪湖 241000;2．安徽師范大學生物環(huán)境與生態(tài)安全安徽省高校省級重點實驗室，蕪湖 241000)

隨著我國經(jīng)濟建設(shè)的騰飛，工礦業(yè)的迅速發(fā)展，環(huán)境污染問題也日益嚴峻，其中土壤的重金屬污染更是令人堪憂。在此背景下，土壤的銅污染已經(jīng)日益成為人們關(guān)注的焦點，而銅污染土壤的修復和治理也作為一個全球性研究課題，吸引著眾多的學者和專家。經(jīng)過近年來的不斷探索，污染土壤的植物修復技術(shù)由于其成本低、效果顯著以及不會造成二次污染等優(yōu)點，為解決土壤重金屬污染問題提供了一條新的綠色途徑［1］。

重金屬在土壤中一般以多種形態(tài)賦存，不同的化學形態(tài)對植物的有效性不同。重金屬生物有效態(tài)是指能被植物所吸收的那部分重金屬［2］。植物修復的首要目標應是減少土壤有效態(tài)重金屬濃度，而不是土壤重金屬總量，所以植物修復技術(shù)的效率在很大程度上取決于對重金屬生物有效態(tài)的吸收［3］。

研究表明，螯合劑對土壤中的重金屬有一定的活化作用，能夠通過擾動污染物在土壤液相濃度和固相濃度之間的平衡，提高重金屬的有效態(tài)含量。這種施用螯合劑或配位基誘導或強化植物超富集作用被稱為螯合誘導修復技術(shù)(Chelate-induced phytoremediation)。林琦等人研究認為，檸檬酸可降低土壤對鉛、鎘的吸附，即活化了土壤中的鉛和隔［4］。吳龍華等人對人工螯合劑EDTA進行了研究，發(fā)現(xiàn)施用3mmol/kg EDTA大幅度提高了土壤溶液中銅、鋅、鎘和鉛的濃度［5］。

觀賞植物吊蘭(Chlorophytum comosum)隸屬于百合科吊蘭屬，具有分布性廣，環(huán)境競爭力強和易于栽培等特點，對重金屬具有較好的耐性與積累特性［6］。檸檬酸(Citric acid，CA)是一種低分子有機酸，為天然螯合劑;EDTA(Ethylenediaminetetraacetic acid，乙二胺四乙酸)則是人工合成螯合劑的代表性物質(zhì)。

本文采用吊蘭對土壤中的銅進行提取，通過對相關(guān)指標的實驗分析，初步討論了在梯度濃度檸檬酸或EDTA的影響下，銅污染土壤中吊蘭生長狀況的變化，為檸檬酸和EDTA在土壤植物修復中的應用提供了理論基礎(chǔ)和科學依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 實驗材料

供試植物為吊蘭。2011年9月自吊蘭母枝剪下帶有氣生根的吊蘭幼苗，培養(yǎng)2周，待幼苗生根穩(wěn)定后，選取根長5cm、株高8cm左右，生長狀況近似的幼苗進行實驗。供試土壤來源于安徽師范大學后山，基本性質(zhì)為黃棕壤，最大持水量為60%，有機質(zhì)含量13．35g/kg，全氮、全磷、全鉀和土壤全銅含量分別為1．25、0．15、10．89、26．35g/kg。

1．2 實驗設(shè)計

土壤風干后過2mm篩備用。在直徑為12．5cm的塑料花盆中分別加入上述土壤250g，在前期預實驗的基礎(chǔ)上，一次性加入CuSO4·5H2O，使土壤的初始銅含量為400mg/kg，以不添加銅的土壤作為空白組(CK)，將土壤靜置2周。

靜置結(jié)束后，將吊蘭幼苗栽入實驗組盆中，每盆2株。(每種處理各設(shè)置4盆:3盆為栽種吊蘭的實驗組，1盆為不種吊蘭的對照組。)吊蘭栽培20d后，采用滴灌的方法施加檸檬酸或EDTA溶液。檸檬酸和EDTA分別設(shè)置了 5 個處理濃度，即 0、2．5、5、7．5、10mmol/L，施加量為 5mL/d，共 40d。待栽培結(jié)束，立即對土壤和吊蘭的相關(guān)指標進行實驗分析。

1．3 實驗方法

1．3．1 土壤全銅和有效態(tài)銅含量的測定

將花盆中的土壤倒出，風干，過0．1mm篩備用。取土樣經(jīng)鹽酸-硝酸-高氯酸消解后，使用日本島津(SHIMADZU)AA-6800型原子吸收分光光度計，以火焰原子吸收分光光度法測定其全銅含量。另取土樣經(jīng)0．1mol/L稀HCl浸泡并振蕩90min后，同樣采用火焰原子吸收分光光度法測定其有效態(tài)銅含量。

1．3．2 吊蘭銅富集量的測定

稱取烘干后的吊蘭材料粉末 0．2g，加 10mL 混酸(HNO3∶60%HCLO4∶H2SO4=8∶1∶1)浸泡過夜。次日高溫消化至溶液澄清，以0．5%HCl定容至25mL。雙層濾紙過濾，取濾液，用日本島津(SHIMADZU)AA-6800型原子吸收分光光度計測定其吸光度和對應的待測液銅濃度，分別計算吊蘭地上部分和地下部分的銅含量，單位為mg/kg。

1．3．3 吊蘭形態(tài)學指標的測定

將吊蘭從盆中連根移出，仔細清理掉附著在根系表面的土壤，并用刻度尺(最小分度單位為mm)分別量取吊蘭的根長(cm)和株高(cm)。

1．3．4 吊蘭生物量的測定

將吊蘭洗凈，用剪刀從根部剪開，再用電子天平分別稱取其地上部分和地下部分鮮重(g)。

1．3．5 吊蘭葉片幾種生理指標的測定

電導率(Electrical conductivity，EC):剪取吊蘭葉片0．2g，剪成1cm長小段，加20mL雙蒸水浸泡，振蕩90min，用DDS-11A數(shù)顯電導儀測定電導率，單位為μs/cm。

分別以TCA和丙酮提取丙二醛(Malondialdehyde，MDA)和葉綠素(Chlorophyll，Chl)，并用WFJ7200型可見光分光光度計測定其含量［7］。

1．3．6 吊蘭葉片抗氧化酶活性的測定

過氧化氫酶(Catalase，CAT)的活性測定采用高錳酸鉀滴定法［8］。

過氧化物酶(Peroxidase，POD)的活性測定采用愈傷木酚法［7］。

超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)的活性測定采用NBT光還原法［7］。

1．4 數(shù)據(jù)分析

本節(jié)主要采用的是Microsoft Excel 2003和SPSS 17．0兩種軟件。使用Microsoft Excel 2003對平行樣的平均值和標準差進行計算，同時使用SPSS 17．0進行不同處理之間的多重比較，以及數(shù)據(jù)之間的相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與討論

2．1 檸檬酸和EDTA對土壤中銅含量的影響

如圖1所示，隨著檸檬酸施加濃度的上升，土壤全銅含量先增大后減小，且在檸檬酸濃度為7．5mmol/L時達到峰值394．9mg/kg，顯著高于不施加檸檬酸時的371．2mg/kg;在EDTA濃度為2．5mmol/L時，土壤全銅的含量達到最大值384．8mg/kg，高于在相同濃度檸檬酸調(diào)節(jié)下的土壤全銅含量，而在其他濃度的EDTA處理下，土壤全銅含量均低于檸檬酸的處理結(jié)果。

土壤中重金屬的環(huán)境行為和生態(tài)效應除了受到土壤中重金屬的總含量的影響，主要取決于其存在的形態(tài)，即生物有效態(tài)。有效態(tài)一般主要是指提取的水溶態(tài)和交換態(tài)等重金屬，這部分重金屬在土壤中具有較大的活性，容易被植物所吸收利用［9］。因此，土壤有效態(tài)銅含量的變化可以直接反映檸檬酸和EDTA對銅的活化效果的優(yōu)劣。

如圖2所示，隨著檸檬酸處理濃度的上升，土壤中有效態(tài)銅的含量同樣是先增大后減小，且在檸檬酸濃度為5mmol/L時達到峰值255．4mg/kg，顯著高于不施加檸檬酸時的235．45mg/kg;EDTA對土壤銅的活化效果要低于相同濃度的檸檬酸，且土壤有效態(tài)銅含量在EDTA的影響下出現(xiàn)波動，也在濃度為5mmol/L時達到峰值 245．25mg/kg。

圖1 檸檬酸和EDTA對土壤全銅含量的影響Fig．1 Effects of CA and EDTA on content of total copper in soil

圖2 檸檬酸和EDTA對土壤有效態(tài)銅含量的影響Fig．2 Effects of CA and EDTA on content of available copper in soil

由圖1、圖2可知，低濃度的檸檬酸和EDTA能夠顯著活化土壤中的銅，而這種活化作用在高濃度水平時卻有所降低。這可能是由于高濃度的檸檬酸和EDTA會讓土壤的pH值略有下降，從而使土壤中的各種生理生化活動都受到一定的影響，間接導致了這兩種螯合劑對土壤銅活化作用的減弱。

可見，檸檬酸和EDTA對土壤銅的活化作用均在濃度為5mmol/L時達到最大，且檸檬酸的活化效果更強。

2．2 檸檬酸和EDTA對吊蘭富集作用的影響

由圖3可知，隨著檸檬酸濃度的增大，吊蘭對銅的富集量先上升后下降，地下部分富集量在檸檬酸濃度為2．5mmol/L時達到峰值1078．25mg/kg;地上部分的富集量在檸檬酸濃度為5mmol/L時達到峰值190．188mg/kg。由此可見，吊蘭的地下部分比地上部分對檸檬酸更為敏感。在EDTA的調(diào)節(jié)下，吊蘭對銅的富集量出現(xiàn)了大幅度的波動，且地下部分富集量明顯低于相同濃度條件下檸檬酸調(diào)節(jié)的吊蘭，其最大富集量出現(xiàn)在EDTA濃度為5mmol/L時，為808．375mg/kg，僅為檸檬酸調(diào)節(jié)下吊蘭地下部分最大富集量的74．97%?？梢钥闯?，檸檬酸比EDTA對吊蘭富集量的影響更大。

圖3 檸檬酸和EDTA對吊蘭富集作用的影響Fig．3 Effects of CA and EDTA on copper enrichment of C．comosum

由圖2和圖3可知，在檸檬酸和EDTA的作用下，吊蘭對銅富集量的變化趨勢與土壤中有效態(tài)銅含量的變化趨勢基本吻合。經(jīng)SPSS分析，在檸檬酸和EDTA的影響下，土壤的有效態(tài)銅含量與吊蘭地下部分的銅富集量為顯著性正相關(guān)(表1)。結(jié)合本章第一節(jié)的討論，可以得出以下結(jié)論:由于檸檬酸對土壤中銅的活化能力較強，所以其對吊蘭富集作用的影響比EDTA大。

表1 土壤有效態(tài)銅含量與吊蘭對銅富集量的相關(guān)性分析Table 1 Correlation analysis of available copper in soil and copper enrichment of C．comosum

此外，生物富集系數(shù)(BC)是指植物中重金屬的濃度除以土壤的全銅濃度所得到的值。通常用來描述植物對重金屬的富集能力［10］。如圖4所示，在檸檬酸影響下吊蘭的BC曲線高于EDTA影響下的吊蘭，且值均大于1，這進一步肯定了以上結(jié)論。為什么檸檬酸和EDTA在高濃度時會明顯抑制吊蘭對土壤銅的吸收呢?首先，由2．1部分的討論可知，

在高濃度螯合劑的影響下，土壤有效態(tài)銅的含量有所降低，這直接影響了吊蘭對銅的富集效果;其次，高濃度螯合劑施入土壤后會與陽離子形成穩(wěn)定的絡(luò)合物，而復雜結(jié)構(gòu)形態(tài)的重金屬生物活性較差，所以會抑制植物對其的吸收作用［11］。因此，低濃度的檸檬酸和EDTA通過活化土壤中的銅，能夠促進吊蘭對銅的吸收;而高濃度的檸檬酸和EDTA使土壤溶液中的高穩(wěn)定螯合劑-重金屬復合物增多，反而不利于吊蘭的吸收。

2．3 檸檬酸和EDTA對銅污染條件下吊蘭生長的影響

2．3．1 檸檬酸和EDTA對銅污染條件下吊蘭形態(tài)學指標的影響

圖4 檸檬酸和EDTA對吊蘭富集系數(shù)的影響Fig．4 Effects of CA and EDTA on bioaccumulation coefficient of C．comosum

由表2可知，吊蘭的根長在檸檬酸濃度低于2．5mmol/L時下降，在檸檬酸濃度高于2．5mmol/L時數(shù)值明顯上升;吊蘭株高以5mmol/L檸檬酸為界，先減小后變大。這與檸檬酸對吊蘭地下部分和地上部分銅富集量的影響恰好相反，說明檸檬酸對土壤銅的活化作用將間接抑制吊蘭的生長。

表2 檸檬酸對吊蘭形態(tài)學指標的影響Table 2 Effects of CA on morphological indicators of C．comosum

本實驗采用的土壤銅濃度為400mg/kg，接近吊蘭存活條件的臨界值，在這種水平的銅脅迫下，吊蘭生長會受到一定程度的抑制。從相關(guān)性系數(shù)上看，在檸檬酸和EDTA的影響下，吊蘭根長與土壤有效態(tài)銅含量呈不顯著負相關(guān)，吊蘭株高則是與兩種螯合劑的濃度變化基本無關(guān)。然而，吊蘭的根長和株高均在檸檬酸濃度為10mmol/L 時達到最大值，分別是 15．03、19．58cm，都超過了空白組(CK)的數(shù)值13．8、15．1cm，耐性指數(shù) TI也達到了最大值108．94%。也就是說，在高濃度檸檬酸的作用下，銅污染土壤中吊蘭的形態(tài)學指標恢復到了正常生長水平以上。可以看出，檸檬酸本身對吊蘭的生長可能還具有一定的促進作用。

已知在EDTA的影響下吊蘭對土壤銅的富集量呈波動狀態(tài)。如表3所示，隨著EDTA濃度的上升，吊蘭的形態(tài)學指標數(shù)據(jù)也呈現(xiàn)出不規(guī)律波動的變化趨勢。其中，根長只在EDTA濃度為5mmol/L時與不添加EDTA時的值差異顯著，株高則在各個處理之間均表現(xiàn)為差異不顯著。說明EDTA對銅污染土壤中吊蘭的生長沒有明顯的影響。

表3 EDTA對吊蘭形態(tài)學指標的影響Table 3 Effects of EDTA on morphological indicators of C．comosum

2．3．2 檸檬酸和EDTA對銅污染條件下吊蘭生物量的影響

如圖5，與形態(tài)學指標相似，在檸檬酸的影響下，吊蘭的鮮重水平以5mmol/L檸檬酸為轉(zhuǎn)折點先減小后變大;在EDTA的影響下，吊蘭的生物量大致呈現(xiàn)出了無顯著差異性的波動。結(jié)合2．1部分的討論，吊蘭生物量的變化與吊蘭對土壤銅的富集量密切相關(guān)，即吊蘭的生物量間接地與檸檬酸和EDTA對土壤銅的活化作用相關(guān)。

圖5 檸檬酸和EDTA對吊蘭生物量的影響Fig．5 Effects of CA and EDTA on biomass of C．comosum

2．3．3 檸檬酸和EDTA對銅污染條件下吊蘭葉片幾種生理指標的影響

當植物處于逆境時，自由基增多，作用于脂質(zhì)發(fā)生過氧化反應，產(chǎn)生的大量活性氧會打破動態(tài)平衡，給植物體造成嚴重的損傷，從而導致電解質(zhì)外泄。因此，電導率(EC)是檢測葉片損傷程度的重要指標。而葉綠素含量(Chl)則是反映植物光合作用強度的指標之一［13-14］。

由表4、表5可知，在土壤中加入檸檬酸和EDTA后，吊蘭葉片的電導率以較大幅度的波動對銅脅迫產(chǎn)生應答，且電導率的實驗組數(shù)據(jù)均比空白組(CK)大。葉綠素含量則呈現(xiàn)出幅度較小的變化。由表中的相關(guān)性系數(shù)可知，兩種螯合劑對吊蘭生理指標的影響雖不顯著，但相比而言，檸檬酸的影響要略小于EDTA。

可以看出，檸檬酸和EDTA對因土壤銅污染而受到損傷的吊蘭葉片沒有明顯的修復作用。

表4 檸檬酸對吊蘭幾種生理指標的影響Table 4 Effects of CA on some physiological indexes of C．comosum

表5 EDTA對吊蘭幾種生理指標的影響Table 5 Effects of EDTA on some physiological indexes of C．comosum

2．3．4 檸檬酸和EDTA對銅污染條件下吊蘭葉片的丙二醛含量和抗氧化酶活性的影響

當植物受到環(huán)境脅迫時，會由于自由基增多而導致過氧化損傷，而氧化終產(chǎn)物丙二醛(MDA)則常被用來指示植物葉片的受損程度。如表6、表7所示，在土壤中加入檸檬酸和EDTA后，吊蘭葉片的丙二醛含量表現(xiàn)為各個處理之間無統(tǒng)計學差異，且實驗組數(shù)據(jù)均比空白組(CK)大。

細胞中H2O2的積累能降低CO2的固定效率，尤其是H2O2和通過Haber-Weiss反應會產(chǎn)生更多的活性氧，所以及時清除H2O2對防止活性氧十分重要。在正常情況下，生物體會通過抗氧化酶的聯(lián)合作用對活性氧自由基進行清除，以減輕機體損傷。超氧化物歧化酶(SOD)是的凈化劑，通過消除;過氧化氫酶(CAT)可將高濃度的H2O2清除;過氧化物酶(POD)可清除植物組織中產(chǎn)生的低濃度的

當生物體受到輕度逆境脅迫時，抗氧化酶活性會應激性升高，增強對活性氧的清除能力;當受到重度環(huán)境脅迫時，細胞抗氧化系統(tǒng)的平衡遭到破壞，抗氧化酶活性會受到抑制，體內(nèi)活性氧積累，帶來機體損傷，所以抗氧化酶活性也是反映生物體對環(huán)境脅迫適應程度的重要指標［17］。在土壤銅濃度為400mg/kg的環(huán)境下，吊蘭的抗氧化酶活性應該是處于受到抑制的狀態(tài)。

如表6、表7所示，在檸檬酸和EDTA的作用下，吊蘭葉片CAT的活性出現(xiàn)小幅度波動，可見檸檬酸和EDTA對銅污染環(huán)境下吊蘭CAT活性所受到的抑制沒有明顯的緩解作用。

在檸檬酸和EDTA的影響下，實驗組吊蘭的POD活性表現(xiàn)為先顯著低于空白組(CK)，后隨著檸檬酸和EDTA濃度的升高而有所上升，特別是EDTA調(diào)控下的吊蘭POD活性呈現(xiàn)出明顯的上升趨勢，在EDTA濃度為7．5mmol/L時達到最大值111．833U·min-1·g-1，顯著高于不添加EDTA時的73．167U·min-1·g-1，活性提高了 52．846%。

實驗組吊蘭的SOD活性雖然隨著檸檬酸和EDTA濃度的增加有一定的波動，但仍表現(xiàn)為低于空白組(CK)，甚至高濃度處理組還低于未施加調(diào)節(jié)劑的組別。這是由于在受到脅迫時，SOD的靈敏度較高，通常會首先發(fā)生變化［18］。且根據(jù)相關(guān)性分析的結(jié)果也不難看出，吊蘭的抗氧化酶活性對兩種螯合劑的敏感度依次為:SOD＞POD＞CAT。因此在高濃度銅的脅迫下，吊蘭的SOD活性整體上是受到抑制的，而且檸檬酸和EDTA對土壤中銅的活化可能還加重了這種抑制。

從以上分析可以得出，檸檬酸和EDTA對銅污染環(huán)境下吊蘭抗氧化酶活性的影響主要體現(xiàn)在有利于POD活性的提高，且EDTA效果較好。

表6 檸檬酸對吊蘭的丙二醛含量和抗氧化酶活性的影響Table 6 Effects of CA on content of MDA and activities of antioxidant enzymes of C．comosum

表7 EDTA對吊蘭的丙二醛含量和抗氧化酶活性的影響Table 7 Effects of EDTA on content of MDA and activities of antioxidant enzymes of C．comosum

3 結(jié)論

(1)檸檬酸和EDTA對吊蘭富集量的影響與其對土壤中銅的活化能力呈顯著性正相關(guān)。檸檬酸對土壤銅有較強的活化作用，能夠有效提高吊蘭對銅的吸收，且在濃度為5mmol/L時效果最為明顯;而EDTA對吊蘭富集作用的影響相對較弱。

(2)檸檬酸本身對吊蘭生長可能具有一定的促進作用，但其通過提高吊蘭的銅富集量，間接抑制了吊蘭的生長，且這種抑制主要體現(xiàn)在形態(tài)學指標和生物量上;EDTA對吊蘭生長無顯著影響，對吊蘭葉片的POD活性卻有明顯的促進作用。相比而言，檸檬酸對吊蘭生長狀況的影響比EDTA大。

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