外源NO對鎘脅迫下水稻幼苗抗氧化系統(tǒng)和微量元素積累的影響

朱涵毅，陳益軍，勞佳麗，沈 梁，李菲菲，米 蘭，王慧中，薛大偉

(杭州師范大學生命與環(huán)境科學學院，杭州 310036)

鎘(Cd)是重要的工業(yè)和環(huán)境污染物，也是毒性最強的重金屬之一，極易被植物吸收并積累，超過一定限度時嚴重影響作物的產量和品質，進而嚴重威脅人類健康。作物生長在有毒重金屬污染的土壤上，其生長發(fā)育將受到嚴重抑制。Cd對植物的毒害，在形態(tài)上主要表現(xiàn)為根、莖生長遲緩和葉片失綠、卷曲;生理生化方面多表現(xiàn)為光合作用和蒸騰作用受到抑制，引起氧化脅迫和膜的損傷等［1］?，F(xiàn)已明確，Cd對水稻的毒害主要有:阻礙水稻根系生長、影響種子萌發(fā)及植株生長，最終導致生物量和產量的下降;在生理上造成氧化脅迫以及葉綠素、糖類、蛋白質等大分子合成受阻，體內養(yǎng)分失調及其它一系列生理代謝紊亂［2］。Cd還可能通過影響水稻細胞質膜的透性從而影響一些營養(yǎng)元素的吸收和積累，導致植株和籽粒中營養(yǎng)元素和成分的改變［3］。Cd被認為是南方土壤污染中常見的重金屬元素，一般土壤中的Cd含量己超過土壤正常值。因此，研究Cd對農作物，尤其是對水稻的影響，成為研究重金屬污染的熱點。

一氧化氮(Nitric Oxide，NO)廣泛存在于植物組織中，是植物體內一種重要的氧化還原信號分子，屬于活性氮范疇。NO參與植物種子萌發(fā)、生長發(fā)育、光形態(tài)建成、衰老等一系列生理過程［4-6］。近年來的研究表明，NO作為植物體內的一種活性信號因子，還參與了植物對各種脅迫的應答［7-9］。研究發(fā)現(xiàn)，0．1和1 mmol/L SNP(硝普鈉，一氧化氮供體)處理能顯著增強小麥幼苗SOD和CAT活性，降低由NaCl處理引起的小麥葉片氧化損傷。NO能有效緩解Cu對水稻的毒害效應［10］。NO還能通過提高鹽脅迫下蘆葦愈傷組織中質膜H+-ATPase的表達和活性，進而提高組織中K+/Na+而提高抗鹽性［11］。Wang和Yang研究發(fā)現(xiàn)NO能顯著緩解Al對決明子的毒害［12］，NO預處理能顯著緩解Al對植株生長的抑制，減少Al脅迫引起的脂質過氧化和ROS的積累。劉建新等研究發(fā)現(xiàn)［13］，外源NO通過提高Cd脅迫下植株體內的SOD、APX、CAT活性及GSH含量，來增強活性氧的清除能力，保護由Cd脅迫引起的黑麥草幼苗葉片光合機構的破壞，緩解Cd脅迫對幼苗生長的抑制作用。Besson-Bard等通過對Cd脅迫下擬南芥基因差異表達分析發(fā)現(xiàn)，NO可能通過誘導根部IRTI基因的上調表達，使Cd大量截留在根部，減少地上部Cd的積累從而緩解Cd毒害，說明NO參與了Cd脅迫下植物對重金屬離子的吸收與轉移。目前NO緩解Cd對水稻毒害的研究特別是對微量元素積累的影響研究較少，因此本研究以兩個基因型水稻幼苗為實驗材料，通過對其生長狀況、抗氧化酶系活性、Cd和3種微量元素的含量進行分析，研究外源NO對Cd脅迫下水稻幼苗的抗性和生理生化機制，以期為Cd污染治理和水稻的重金屬Cd抗性研究提供理論參考。

1 材料與方法

1．1 供試材料

供試材料為秈稻品種ZF802和粳稻品種ZH11，浸種后催芽3 d，轉入沙盒培養(yǎng)，采用1/2國際水稻所營養(yǎng)液配方［14］澆灌。長至3葉期轉入水培箱中培養(yǎng)，并進行處理。

1．2 試驗設計

每個品種設置3個處理:對照組(采用國際水稻所營養(yǎng)液配方進行培養(yǎng))、100 μmol/L Cd2+和100 μmol/L Cd2++1．5 mmol/L SNP。3組分別用CK、Cd、Cd+1．5SNP表示。營養(yǎng)液每3 d更換1次，實驗重復3次。培養(yǎng)3周后對水稻根和葉的各項指標進行測定。

1．3 測定方法

處理3周后取植株樣，根系在乙二胺四乙酸二鈉溶液中(20 mmol/L)浸泡3 h去除表面粘附的離子，再用蒸餾水洗凈，分別測量株高和根長，并將地上部和根系分開，殺青后，80℃恒溫烘干，用原子吸收光譜儀(AA6300，Shimadzu，Tokyo，Japan)分析 Cd和微量元素［15］。

丙二醛(MDA)含量測定采用硫代巴比妥酸分光光度法［16］;抗氧化酶活性測定參照張憲政介紹的方法［17］，并略加改動(主要增加95%乙醇二次洗滌過程，提高純度)。超氧化物歧化酶(SOD)活性測定采用氯化硝基四氮唑藍(NBT)光化還原法［18］;過氧化物酶(POD)活性測定采用愈創(chuàng)木酚氧化法。用SHIMADZU UV-2410PC分光光度計酶動力學軟件測定吸光度的變化。

1．4 數據分析

利用Excel軟件進行數據的分類匯總，用SPSS15．0軟件進行數據分析及差異顯著性檢驗。

2 結果與分析

2．1 外源NO對鎘脅迫下水稻幼苗根長和株高的影響

水稻幼苗根系在100 μmol/L Cd2+處理7 d后呈現(xiàn)棕黃色，14 d后變褐色并逐漸壞死。葉尖在處理10 d后逐步失綠，14 d后葉尖呈現(xiàn)褐色的壞死斑，葉色變黃，植株生長矮小，兩個基因型水稻在Cd2+脅迫下根長和株高均明顯下降(圖1)。添加1．5 mmol/LSNP有效緩解了水稻幼苗Cd毒害的癥狀，兩個基因型的株高和根長均比Cd處理下顯著提高，基本恢復到對照水平，其中秈稻ZF802的根長甚至超過了對照。

圖1 Cd脅迫下外源NO對水稻幼苗根長株高的影響Fig．1 Effect of exogenous NO on the roots length and the plant height of the rice seedlings under Cd stress

2．2 外源NO對不同基因型水稻Cd積累的影響

與野生型對比可以發(fā)現(xiàn)，Cd處理下兩種水稻幼苗地上部Cd含量均有顯著提高，通過施加外源1．5 mmol/L SNP后發(fā)現(xiàn)，NO對兩種水稻品種地上部和根部Cd積累量影響差異較大。ZF802地上部在施加SNP后，Cd含量會明顯降低;而ZH11則略有升高(圖2)。而在根部情況相反，外源SNP顯著降低了ZH11根部的Cd含量，卻提高ZF802的根部Cd含量(圖2)，存在基因型差異。

2．3 外源NO對不同基因型水稻微量元素積累的影響

Cd處理顯著影響了植株對微量元素的吸收和分配，且存在一定的基因型差異。Cd處理下，ZF802和ZH11地上部Mn和Zn含量較對照下降，特別是ZF802地上部的Mn含量比對照下降了64．5%;但在Cd處理下，ZF802地上部Cu含量較對照增加，而ZH11的Cu含量卻比對照下降了34．9%(圖3)。

而在根部中，兩個基因型Zn、Mn、Cu含量在Cd處理下變化更具差異，ZF802根部Mn、Cu含量比對照均下降，而Zn含量顯著升高;但ZH11恰恰相反，根部Mn、Cu含量比對照均增加，而Zn含量則下降(圖4)。外源NO的添加使ZF802地上部Zn、Cu的含量降低，Mn含量升高;而ZH11地上部Zn、Cu含量在添加外源NO后比Cd處理有所升高，Mn含量下降(圖3)。在根部中，除Cu外，施加外源NO后，兩個基因型的Mn、Zn含量均較Cd處理顯著下降，ZF802和ZH11的Zn含量分別較Cd處理下降了43．7%和37．7%;添加SNP后，ZF802根部的Cu含量顯著上升，但ZH11的Cu含量卻顯著下降，具有明顯的基因型差異。

圖2 外源NO對水稻幼苗地上部分和根部Cd含量的影響Fig．2 Effect of exogenous NO on Cd content in the shoot and the root of rice seedlings under Cd stress

圖3 外源NO對水稻幼苗地上部微量元素含量的影響Fig．3 Effect of exogenous NO on microelements content in the shoot of rice seedlings under Cd stress

圖4 外源NO對水稻幼苗根部微量元素含量的影響Fig．4 Effect of exogenous NO on microelements content in the root of rice seedlings under Cd stress

2．4 鎘脅迫下外源NO對抗氧化酶系統(tǒng)的影響

SOD是植物體內清除氧自由基的一種重要的保護酶。兩個基因型在處理之間SOD活性的變化存在顯著的差異，Cd處理3周后，ZF802的SOD活性比對照略低，而加入外源SNP與Cd處理相比SOD活性也基本沒有變化，但是ZH11在Cd處理下，SOD活性顯著上升，加入外源SNP后，SOD活性與Cd處理相比下降(圖5)?？傮w上ZH11的SOD活性高于ZF802，能有效地清除自由基，說明SNP能緩解Cd毒害引起的氧化脅迫。從圖6中可以看出，兩個基因型葉片POD活性在Cd脅迫下均顯著上升。添加外源SNP后，兩個基因型葉片POD活性較Cd處理有所下降，基本能恢復到對照水平，這也說明了SNP可以緩解Cd脅迫下水稻體內的氧化脅迫。

2．5 鎘脅迫下外源NO對丙二醛含量的影響

植物器官在逆境條件下會發(fā)生脂膜過氧化作用，丙二醛是脂膜過氧化作用的最終產物之一，也是膜系統(tǒng)受害的重要指標之一，可用于表示細胞脂膜過氧化程度和植物對逆境條件反應的強弱。圖7反映了Cd脅迫下兩個基因型的MDA含量，結果表明，Cd脅迫3周后，二者的葉片MDA含量均上升，其中ZF802上升較ZH11顯著，說明細胞膜傷害較嚴重。而添加外源NO后，兩個基因型葉片的MDA含量均回落，ZF802葉片的MDA含量比Cd處理下降了36．5%，但仍高于對照;而ZH11的MDA含量比Cd處理下降了22．5%，甚至略低于對照水平。這也說明NO在緩解Cd脅迫下植物細胞脂膜過氧化過程中具有重要作用，同時不同基因型間具有明顯的差異。

圖5 Cd脅迫下外源NO對水稻幼苗SOD活性的影響Fig．5 Effect of exogenous NO on activity of SOD in rice seedlings under Cd stress

圖6 Cd脅迫下外源NO對水稻幼苗POD活性的影響Fig．6 Effect of exogenous NO on activity of POD in rice seedlings under Cd stress

3 討論

Cd是目前對農作物毒害最普遍的重金屬之一，Cd脅迫對植物的傷害是多方面的。它能誘導活性氧的產生，導致膜質過氧化和生物大分子的損傷，從而使光合作用等生理過程發(fā)生紊亂，抑制植株的生長。本實驗結果表明，不同基因型水稻在Cd脅迫下根長和株高均受到抑制，水稻生長發(fā)育受影響，與前人結果相同。NO是植物體內的一種重要的活性信號因子，可參與植物對各種脅迫的應答。SNP是一種最常用的外源NO供體，研究表明，0．5 mmol/L SNP 大約可釋放 2．0 μmol/L 的NO。Laspina等發(fā)現(xiàn)SNP處理可以顯著緩解Cd脅迫對向日葵幼苗生長的抑制，提高了向日葵抗Cd脅迫的能力［19］。本研究發(fā)現(xiàn)通過施加外源NO供體SNP可以緩解Cd脅迫對水稻幼苗生長的抑制。

圖7 Cd脅迫下外源NO對水稻幼苗丙二醛含量的影響Fig．7 Effect of exogenous NO on MDA content in rice seedlings under Cd stress

逆境脅迫對植物的傷害是多方面的，其中膜系統(tǒng)是植物受傷害的敏感部位和原初位點。逆境首先引起植物離子失衡和高滲脅迫，并導致包括氧化傷害的次生脅迫，例如各種活性氧(ROS)的積累，導致膜結構完整性的破壞，葉綠素降解、蛋白質變性、核酸斷裂，甚至細胞死亡。植物體內SOD、POD等抗氧化酶活性對維持膜結構完整性和防御活性氧自由基對膜的攻擊有重要作用［20］，SOD和POD共同作用可將H2O2轉化為H2O，使自由基維持在一個較低水平，從而避免膜傷害。酶活性測定結果表明，Cd脅迫下誘導兩個基因型葉片POD顯著上升(圖6)，說明Cd脅迫誘導抗氧化酶活性增強，從而清除自由基，阻止植物體內ROS的積累。但Cd處理后兩個基因型SOD活性表現(xiàn)差異顯著，其中ZH11葉片SOD活性顯著增強，而ZF802葉片SOD活性在處理3周后下降，這可能是由于Cd脅迫時間過長，導致ZF802的葉片保護酶系統(tǒng)的崩潰，而ZH11對Cd耐性較強，葉片保護酶系統(tǒng)破壞較小。已有大量報道表明外源NO能夠起到緩解重金屬脅迫的作用［21］，但其解毒機制一直未明確?，F(xiàn)在主要認為是由于外源NO通過減少氧化脅迫來緩解重金屬毒害。Tewari等研究表明外源NO能夠緩解Cu毒害引起的人參不定根中產生的氧化脅迫［22］，Wang等的研究也表明外源NO是通過緩解氧化脅迫來降低Al對肉桂根系的毒害作用。而對于外源NO緩解氧化脅迫的機理目前主要存在兩種觀點。Kopyra和Gwóz'dz'認為外源NO的這種抗氧化脅迫是通過直接清除ROS來實現(xiàn)的［23］，劉建新等人認為NO的抗氧化脅迫能力并非直接參與ROS的清除，而是提高了抗氧化酶系的活性，這與Jiang等［24］和胡向陽等［25］的觀點一致。本研究表明，加入外源SNP后，兩個基因型葉片中的SOD和POD活性均下降，NO可以作為抗氧化劑直接清除體內積累的ROS，使Cd脅迫下活性增強的酶活性下降。

植物在逆境脅迫下，活性氧的過量積累會引起膜脂過氧化，破壞細胞膜系統(tǒng)穩(wěn)定和完整，進而導致植物細胞結構的損傷［26］。本研究也發(fā)現(xiàn)，Cd處理使水稻幼苗葉片MDA含量升高，特別是ZF802細胞膜傷害更加嚴重。MDA含量增加到一定程度的時候可能對抗氧化酶活性有一定的影響，從實驗結果中可以發(fā)現(xiàn)，在Cd處理3周后，MDA的積累很高的ZF802，SOD的活性受到抑制而有所下降(圖5，圖7)，而POD的活性增強(圖6)，也就是說高度積累的MDA對于SOD的活性起抑制作用，而對于POD活性并沒有大的抑制作用。施加外源SNP后，兩個基因型葉片的MDA含量比Cd處理下明顯下降，說明NO在緩解Cd脅迫下植物細胞脂膜過氧化過程中具有重要作用，與前人在小麥中的研究一致［27］。

通過化學調控手段緩解Cd毒害，是降低作物對Cd吸收與積累是作物安全生產的重要手段。前人的研究表明，NO參與了Cd脅迫下植物對重金屬離子的吸收與轉移，通過誘導基因表達，使Cd積累在根部，從而緩解地上部的Cd毒害。本研究發(fā)現(xiàn)秈稻品種ZF802與前人的研究相符，Cd脅迫下地上部和地下部Cd含量均增加，施加外源NO后，地上部Cd含量下降，根部含量增加。但是粳稻品種ZH11卻相反，施加外源SNP后，地上部Cd含量略有升高，而在根部Cd含量卻降低(圖2)，說明NO的施加促使ZH11中的Cd含量從根部更多的轉移到了地上部。這也說明Cd在水稻的體內轉移和分配機制比較復雜，有待于進一步研究。Cd作為一種重金屬離子，在植物體內可能與必需營養(yǎng)元素競爭根部的吸收位點，也可能通過影響植物對養(yǎng)分的吸收，從而影響植物的正常生長［28］。本研究中，Cd脅迫下3種微量元素在根部和地上部的分布存在基因型差異。Cd的存在抑制了ZH11根部對Zn的吸收，增加了對Mn和Cu的積累，但ZF802卻情況相反，根部Zn含量上升。地上部Cu的含量也存在基因型差異。目前對于Cd脅迫影響植物對微量元素的吸收有一些研究，但是得出的結論很不一致［29-30］，有些研究認為Cd對微量元素的影響是通過協(xié)同作用［31］，而有的認為是通過拮抗作用［32］。本研究表明，Cd對Zn、Mn、Cu等微量元素吸收的影響存在基因型差異，與張國平等在小麥上的結果一致［33］。外源SNP能減少Cd脅迫下兩個基因型根部對Zn、Mn的積累，但是對根部Cu的積累和地上部3中微量元素含量的影響卻存在基因型差異。這也說明水稻中NO對Cd處理下微量元素吸收的影響存在基因型差異，且機制比較復雜，需進一步探討。

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