實(shí)時(shí)熒光定量PCR快速診斷肺炎鏈球菌

顏善活，孫 雷，符可鵬，卓永光，楊善業(yè)，樊祖茜，黃永霞

(廣西壯族自治區(qū)欽州市婦幼保健院，廣西 欽州 535000)

肺炎鏈球菌是一種可引發(fā)肺炎、腦膜炎、菌血癥、中耳炎及鼻竇炎等疾病的細(xì)菌[1]。各個(gè)年齡段人群都可能受感染，而2歲以下的幼兒最容易罹患，如果沒有得到及時(shí)的診斷和治療，患者可能會(huì)失聰、智障、癱瘓、延遲會(huì)話能力，甚至死亡[2]。目前，臨床對(duì)社區(qū)獲得性肺炎患者診斷的金標(biāo)準(zhǔn)是通過細(xì)菌培養(yǎng)的檢測方法來確定病原菌，該方法雖然能對(duì)部分病例進(jìn)行診斷和確診，但在臨床應(yīng)用中仍存在許多不足[3]。近年來逐漸發(fā)展起來的實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)為肺炎鏈球菌提供了快速而敏感的診斷方法，解決了傳統(tǒng)方法的不足，相比細(xì)菌培養(yǎng)法其具有無需進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)、不受藥物影響、3～5 h內(nèi)即可完成診斷等特點(diǎn)，不僅能快速對(duì)肺炎鏈球菌感染進(jìn)行診斷，更重要的是能及時(shí)控制病情的發(fā)展。本研究中，為了驗(yàn)證引物及探針的敏感性和特異性，分別利用肺炎鏈球菌自溶素(Lyt)和溶血素(Ply)的基因引物及探針對(duì)肺炎鏈球菌、非肺炎鏈球菌、不同濃度梯度的肺炎鏈球菌以及臨床標(biāo)本進(jìn)行熒光定量PCR。同時(shí)，對(duì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的量與培養(yǎng)陽性的相關(guān)性進(jìn)行了初步探討。

材料和方法

一、材料

1.標(biāo)本來源 標(biāo)本來源于2010年4月至2011年12月欽州市婦幼保健院臨床分離的非重復(fù)的肺炎鏈球菌、經(jīng)過鑒定的非肺炎鏈球菌以及臨床送檢的痰標(biāo)本。

2.主要儀器和試劑 熒光定量PCR儀為達(dá)安基因公司DA7600產(chǎn)品，紫外分光光度計(jì)、高速離心機(jī)、電泳儀等購自美國Labnet公司，電泳凝膠成像分析系統(tǒng)購自美國BIO-RAD公司，熒光定量PCR系列試劑購自天根生化科技(北京)有限公司。

3.PCR引物及Taqman探針的設(shè)計(jì)與合成經(jīng)參考有關(guān)文獻(xiàn)和檢索GenBank，分別以肺炎鏈球菌的lyt和ply基因?yàn)槟康男蛄泻铣梢锛疤结?。ply基因[4]引物序列為:forward 5'-TGCAGAGCGTCCTTTGGTCTAT-3'，reverse 5'-CTCTTACTCGTGGTTTCCAACTTGA-3';ply基因探針為:probe FAM-5'-TGGCGCCCATAAGCAACACTC GAA-3'-TAMRA，lytA 基因[5]引物序列為:forward 5'-ACGCAATCTAGCAGATGAAGC-3'，reverse 5'-TGTTTGGTTGGTTATTCGTGC-3'，lytA基因探針為:probe FAM-5'-TTTGCCGAAAACGCTTGATACAGGG-3'-TAMRA，引物及探針均由金斯瑞生物科技有限公司合成。

二、方法

1.肺炎鏈球菌的培養(yǎng)及鑒定 取臨床痰液標(biāo)本和標(biāo)準(zhǔn)菌株肺炎鏈球菌(ATCC 49619)，分別接種于哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基上，置于5%的二氧化碳培養(yǎng)箱中，在37℃條件下培養(yǎng)18～24 h。采用革蘭染色鏡檢、奧普托欣(optochin)和膽汁溶解試驗(yàn)鑒定。

2.臨床痰液標(biāo)本及培養(yǎng)后的菌株DNA的提取 取接種剩余的痰標(biāo)本1 mL于1.5 mL離心管中或挑取純培養(yǎng)的菌株懸浮于1 mL無菌生理鹽水中，15000×g離心5 min，棄上清。在沉淀中加入裂解液100～150 μL，然后100℃水浴10 min，10000×g離心10 min，上清液作為模板DNA。

3.實(shí)時(shí)熒光定量PCR 以上述方法提取經(jīng)過培養(yǎng)和鑒定后的10株肺炎鏈球菌DNA，分別以其DNA為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，25 μL反應(yīng)體系:引物 1 μL，模板 2 μL，去離子水 9.5 μL，實(shí)時(shí)熒光定量 PCR mix 12.5 μL。擴(kuò)增條件為:93℃預(yù)變性3 min;93℃變性30 min，60℃ 1 min，共42個(gè)循環(huán)，記錄試驗(yàn)結(jié)果并保存擴(kuò)增曲線。

4.特異性試驗(yàn) 對(duì)通過培養(yǎng)并鑒定后的腦膜炎奈瑟菌、流感嗜血桿菌、乳糖奈瑟菌、副流感嗜血桿菌、金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、糞腸球菌、大腸埃希菌、假單胞菌、無乳鏈球菌、釀膿鏈球菌、卡他布蘭漢菌以及人類細(xì)胞組織分別提取DNA，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測，同時(shí)以標(biāo)準(zhǔn)菌株肺炎鏈球菌(ATCC 49619)作為陽性對(duì)照，無菌蒸餾水作為空白對(duì)照。

5.敏感性試驗(yàn) 用棉簽刮取培養(yǎng)基上的純菌苔，按照天根DNA試劑盒中的操作說明提取菌體染色體DNA，可直接用作PCR模板或置－20℃保存?zhèn)溆?。用紫外分光光度?jì)測得參考菌株DNA濃度并調(diào)整至10 ng/μL，用超純水10倍系列稀釋，使其終濃度為 1 ng、100 pg、10 pg、1 pg、100 fg，稀釋好的DNA需立即進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測，并以無菌蒸餾水作為空白對(duì)照。

6.臨床標(biāo)本的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和傳統(tǒng)的細(xì)菌培養(yǎng)法同時(shí)檢測200例臨床痰液標(biāo)本。每次擴(kuò)增均以標(biāo)準(zhǔn)菌株肺炎鏈球菌(ATCC 49619)全基因組DNA為陽性對(duì)照，超純水為陰性對(duì)照;所有相同的標(biāo)本和陰陽性對(duì)照都設(shè)有兩孔以進(jìn)行平行檢測。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行 χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增結(jié)果

利用肺炎鏈球菌的lyt與ply基因?yàn)槟康男蛄性O(shè)計(jì)的引物及Taqman探針，分別對(duì)10株經(jīng)過培養(yǎng)及鑒定的肺炎鏈球菌進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示10株肺炎鏈球菌均獲得了明顯的擴(kuò)增信號(hào)，表明合成的引物及Taqman探針均能有效的擴(kuò)增并檢測出肺炎鏈球菌的lyt基因及ply基因。見圖1(a)、圖1(b)。

二、特異性試驗(yàn)

利用引物及Taqman探針分別對(duì)經(jīng)分離的12株非肺炎鏈球菌以及1例人類細(xì)胞組織DNA進(jìn)行熒光定量PCR檢測，結(jié)果顯示除了肺炎鏈球菌的陽性對(duì)照DNA顯示為陽性外，其他細(xì)菌均無明顯的擴(kuò)增信號(hào)，表明所合成的引物及Taqman探針對(duì)肺炎鏈球菌的lyt基因及ply基因具有高度的特異性。見圖1(c)、圖1(d)。

三、敏感性試驗(yàn)

分別選取菌懸液濃度為1 ng、100 pg、10 pg、1 pg、100 fg的肺炎鏈球菌DNA進(jìn)行定量PCR檢測，ply基因與lyt基因的引物與探針的熒光定量PCR結(jié)果顯示，各個(gè)濃度的肺炎鏈球菌DNA均具有明顯的擴(kuò)增信號(hào)，其檢測的最低肺炎鏈球菌DNA濃度可低至100 fg。見圖2。

圖1 ply及l(fā)yt基因引物與探針的特異性試驗(yàn)

圖2 ply和lyt基因引物與探針的敏感性試驗(yàn)

四、臨床標(biāo)本檢測結(jié)果

利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和細(xì)菌培養(yǎng)法同時(shí)檢測200例臨床標(biāo)本，熒光定量PCR檢測的肺炎鏈球菌陽性標(biāo)本42例(陽性率為21%)，而培養(yǎng)法陽性16例(陽性率為8%)，2種方法比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。ply及l(fā)yt基因的不同擴(kuò)增次方量下細(xì)菌培養(yǎng)陽性的結(jié)果見表1，培養(yǎng)陽性的臨床標(biāo)本在熒光定量PCR檢測中均為陽性，而傳統(tǒng)的細(xì)菌培養(yǎng)法只能檢測部分熒光定量PCR擴(kuò)增量在6次方以上的臨床標(biāo)本。結(jié)果表明，實(shí)時(shí)熒光定量PCR相比傳統(tǒng)細(xì)菌培養(yǎng)法能更快速、特異、敏感地進(jìn)行肺炎鏈球菌的檢測。

表1 細(xì)菌培養(yǎng)和實(shí)時(shí)熒光定量PCR不同擴(kuò)增次方的陽性標(biāo)本量的統(tǒng)計(jì)

討 論

目前，細(xì)菌培養(yǎng)法診斷肺炎鏈球菌在臨床應(yīng)用中存在許多不足，近年來逐漸發(fā)展起來的分子生物學(xué)方法為肺炎鏈球菌的檢測提供了新的方法[6-8]，而實(shí)時(shí)熒光定量 PCR因其具有快速、準(zhǔn)確、特異性高、重復(fù)性好等特點(diǎn)，目前已廣泛用于基因表達(dá)和病原體檢測等諸多領(lǐng)域。本研究通過利用合成的引物及Taqman探針對(duì)肺炎鏈球菌、非肺炎鏈球菌、不同濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)菌株以及臨床標(biāo)本進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，結(jié)果顯示其不僅能特異、敏感的擴(kuò)增并鑒定分離的肺炎鏈球菌菌株，而且還能直接應(yīng)用于臨床標(biāo)本的檢測。

肺炎鏈球菌的lyt基因與ply基因均為常用的靶基因應(yīng)用于肺炎鏈球菌種屬的鑒定。lyt基因是肺炎鏈球菌的致病因子之一，對(duì)肺炎鏈球菌lyt基因測序顯示，肺炎鏈球菌種內(nèi)各血清型的lyt基因序列高度保守，且與其他種的鏈球菌存在較大差異[9]。ply基因是肺炎鏈球菌的 ply基因，Carvalho 等[10]分別以 lyt、ply及 psaA 基因?yàn)槟康幕蛟O(shè)計(jì)引物和探針，并通過熒光定量PCR檢測肺炎鏈球菌對(duì)比其敏感性和特異性，其結(jié)果顯示lyt和psaA基因的特異性相對(duì)較高，而ply基因的引物和探針除了肺炎鏈球菌外，還能夠擴(kuò)增出假肺炎鏈球菌。為了避免ply基因擴(kuò)增中出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增，同時(shí)為了調(diào)查假肺炎鏈球菌的流行及分布情況，我們采用雙重檢測的試驗(yàn)，對(duì)分析鑒定的原始菌液DNA標(biāo)本和臨床送檢標(biāo)本的DNA分別利用所合成的lyt及ply基因引物和探針進(jìn)行熒光定量PCR，結(jié)果lyt及ply基因引物和探針均能進(jìn)行特異性的擴(kuò)增，試驗(yàn)中未出現(xiàn)擴(kuò)增結(jié)果不一致的現(xiàn)象。在后續(xù)試驗(yàn)中，我們將加大擴(kuò)增標(biāo)本的量，鑒定并分離出假肺炎鏈球菌，以檢測肺炎鏈球菌及假肺炎鏈球菌的流行情況。

利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和細(xì)菌培養(yǎng)法同時(shí)檢測200例臨床標(biāo)本，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測出42例肺炎鏈球菌陽性(陽性率為21%)，而培養(yǎng)法陽性標(biāo)本為16例(陽性率為8%)，2種方法比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。其中有26例實(shí)時(shí)熒光定量PCR陽性而細(xì)菌培養(yǎng)法陰性標(biāo)本，其原因可能為:采集標(biāo)本的肺炎鏈球菌的量較少，在與其他細(xì)菌競爭中生長被抑制，從而導(dǎo)致結(jié)果陰性;也可能是患者采樣前使用過一些抗菌藥物從而導(dǎo)致培養(yǎng)陰性。

在試驗(yàn)中，培養(yǎng)陽性的臨床標(biāo)本在熒光定量PCR檢測中均為陽性，并且其擴(kuò)增量都在6次方以上，因此我們推斷，培養(yǎng)法檢測肺炎鏈球菌的敏感性在100 pg以上。實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢出量可低至100 fg，甚至更低，其敏感性完全達(dá)到臨床檢測的要求，當(dāng)然該方法也適合進(jìn)行流行病學(xué)分析調(diào)查。

本研究利用肺炎鏈球菌的lyt和ply基因?yàn)槟康男蛄性O(shè)計(jì)并合成的引物和Taqman探針應(yīng)用于肺炎鏈球菌的檢測，具有敏感性高、特異性強(qiáng)、藥物影響小、檢測速度快、人力花費(fèi)少、經(jīng)濟(jì)實(shí)惠等特點(diǎn)，為臨床肺炎鏈球菌的檢測提供了新的方法。

[1]Cunha BA，Hage JE.Community-acquired pneumonia:diagnostic vs prognostic significance of the platelet count[J].Chest，2011，139(5):1255-1256.

[2]Fang GD，F(xiàn)ine M，Orloff J，et al.New and emerging etiologies for community-acquired pneumonia with implications for therapy:a prospective multicenter study of 359 cases[J].Medicine(Baltimore)，1990，69(5):307-316.

[3]Campbell SG，Marrie TJ，Anstey R，et al.The contribution of blood cultures to the clinical management of adult patients admitted to the hospital with community-acquired pneumonia:a prospective observational study[J].Chest，2003，123(4):1142-1150.

[4]Corless CE，Guiver M，Borrow R，et al.Simultaneous detection of Neisseria meningitidis，Haemophilus influenzae，and Streptococcus pneumoniae in suspected cases of meningitis and septicemia using real-time PCR[J].J Clin Microbiol，2001，39(4):1553-1558.

[5]McAvin JC，Reilly PA，Roudabush RM，et al.Sensitive and specific method for rapid identification of Streptococcus pneumoniae using real-time fluorescence PCR[J].J Clin Microbiol，2001，39(10):3446-3451.

[6]杜 娟，黃金蓮，應(yīng)巧玲，等.痰液降鈣素原檢測在兒童社區(qū)獲得性肺炎中的應(yīng)用[J].檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)，2011，26(3):147-149.

[7]Tait-Kamrsdt AG，Cronan M，Dougherty TJ.Comparative genome analysis of high-level penicillin resistance in Streptococcus pneumoniae[J].Microb Drug Resist，2009，15(2):69-75.

[8]Wessels E，Schelfaut JJ，Bernards AT，et al.Evaluation of several biochemical and molecular techniques for identification of Streptococcus pneumoniae and Streptococcus pseudopneumoniae and their detection in respiratory samples[J].J Clin Microbiol，2012，50(4):1171-1177.

[9]Watson DA，Kapur V，Musher DM，et al.Identification，cloning and sequencing of DNA essential for encapsulation of Streptococcus pneumoniae[J].Curr Microbiol，1995，31(4):251-259.

[10]Carvalho Mda G，Tondella ML，McCaustland K，et al.Evaluation and improvement of real-time PCR assays targeting lytA，ply，and psaA genes for detection of pneumococcal DNA[J].J Clin Microbiol，2007，45(8):2460-2466.