長枝木霉對南方根結線蟲致死和寄生作用的顯微觀察及測定

張樹武， 徐秉良， 薛應鈺， 古麗君

（甘肅農業(yè)大學草業(yè)學院，草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點實驗室，甘肅省草業(yè)工程實驗室，中－美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心，蘭州 730070）

根結線蟲（Meloidogyne spp.）屬于植物根系定居性的寄生線蟲，是當前農作物的病原線蟲之一。近年來，隨著保護地蔬菜栽培的迅速發(fā)展，根結線蟲對蔬菜的危害愈來愈嚴重，尤其是南方根結線蟲[Meloidogyne incognita (Kofoid et White) ]由于其寄主范圍廣、致病性強、繁殖速度快和易傳播擴散等特性，目前已成為世界各地蔬菜種植區(qū)最重要的病原物類群之一［1］。據(jù)聯(lián)合國糧農組織（FAO）估計，美國每年因線蟲危害造成的經(jīng)濟損失為4%，而且主要是南方根結線蟲引起的病害，且在采用防治措施并取得良好防治效果的情況下，每年仍有500萬美元的損失［2］。在我國由于溫室連作現(xiàn)象甚為嚴重，致使許多老齡溫室南方根結線蟲病害的發(fā)生尤為嚴重，一般每年造成10%～15%的經(jīng)濟損失，嚴重者損失可達30%～40%，甚至絕產(chǎn)［3］。同時南方根結線蟲的侵入可造成一定的傷口，有利于土壤中其他病原物的侵入，進而根結線蟲與其他病原微生物聯(lián)合侵染形成復合性病害，進一步加重了其危害程度，如加重了枯萎病、根腐病等土傳性病害的發(fā)生［4］。

目前對南方根結線蟲病害采取的防治措施仍以化學防治為主，種植抗病品種為輔，但大多數(shù)化學殺線劑由于毒性高、品種少、污染環(huán)境和使用過程中對人、畜不安全等缺陷已被禁用［5］。同時抗性品種的應用目前也受到了一定程度的限制，尤其是在一個地區(qū)連續(xù)種植單一抗病品種之后，品種的抗性會逐漸喪失［6］。因此，鑒于化學防治和種植抗病品種的局限性，以及無公害蔬菜生產(chǎn)的要求，對根結線蟲的微生物防治是目前國內外線蟲生物防治的重點和熱點之一。

木霉（Trichoderma）是一類分布廣泛的土壤習居菌［7］。據(jù)有關文獻報道，木霉對一些土傳病原菌具有很好的拮抗作用，如絲核菌屬（Rhizoctonia）、腐霉屬（Pythium）、小核菌屬（Sclerotium）、鐮刀菌屬（Fusarium）等［8］。近年來，對哈茨木霉（Trichoderma harzianumRifai）和綠色木霉（T.viride Pers.exFr.）在植物病原菌的拮抗方面有較多的研究和報道，但有關長枝木霉（T.longibrachiatumRifai）的研究和報道較少，尤其是對南方根結線蟲的致死和寄生作用目前還未見報道。因此，本試驗通過長枝木霉分生孢子懸浮液對南方根結線蟲2齡幼蟲致死和寄生作用過程的顯微觀察，以及致死和寄生作用的測定及作用機理的初步研究，分析和討論長枝木霉殺線蟲作用的有效物質，以便為新型、高效的微生物型殺線劑的研制、開發(fā)和合理應用提供一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

長枝木霉菌株由甘肅農業(yè)大學植物病理學實驗室提供。2011年6月從甘肅省慶陽、榆中、武威等地蔬菜大棚的黃瓜病根和根際病土中分離得到。供試黃瓜品種為‘津研四號’，從甘肅省農科院種子有限責任公司購買。

1.2 試驗方法

1.2.1 長枝木霉分生孢子懸浮液的制備

在PDA平板上培養(yǎng)6d的長枝木霉中加入1滴吐溫－80（Tween－80）和5mL無菌水充分振蕩使長枝木霉分生孢子脫落在無菌水中，即得到長枝木霉分生孢子懸浮液的原液，用血球計數(shù)板計數(shù)原液的濃度（1.5×107個／mL），同時依次稀釋成1.5×106、7.5×105、3.0×105和1.5×105個／mL備用。

1.2.2 根結線蟲的繁殖與接種

采用活體繁殖方法擴繁。將采集的病根（切碎）和根際病土按體積比1∶3的比例混合，然后將其與無病土按體積比1∶5均勻混合，在直徑為10cm的塑料缽內裝入500g混合土樣，每缽種植2株黃瓜，共種植18盆用于擴繁。試驗在溫度為（25±0.5）℃，每天16h光照條件下的溫室中進行。

1.2.3 南方根結線蟲2齡幼蟲的分離

從擴繁的黃瓜根部根結上挑取南方根結線蟲的新鮮卵囊，并將經(jīng)NaClO消毒后的卵囊放入墊有2層擦鏡紙的線蟲分離器中，在25℃下孵化13～20d，即得到大量的南方根結線蟲2齡幼蟲備用。

1.2.4 2齡幼蟲的計數(shù)

采用計數(shù)皿計數(shù)［9］。在體視顯微鏡下計數(shù)每個小格子的2齡幼蟲數(shù)量，然后乘以總格數(shù)，這樣就可以得出每單位計數(shù)皿里2齡幼蟲數(shù)量，然后通過加無菌水到量筒進行定位，即可計算出每毫升無菌水中2齡幼蟲的數(shù)量，最終使其數(shù)量為100條／mL備用。

1.2.5 長枝木霉分生孢子懸浮液對南方根結線蟲2齡幼蟲致死和寄生作用過程的顯微觀察

在高溫滅菌的6孔細胞培養(yǎng)板中加入新孵化的南方根結線蟲2齡幼蟲100條／孔，然后加入3mL濃度為1.5×107個／mL長枝木霉分生孢子懸浮液，以加入3mL無菌水作為對照，試驗共設置1個處理和1個對照，并且每個處理和對照3個重復。試驗在（25±0.5）℃下進行，并每隔2d在顯微鏡下觀察處理中2齡幼蟲被寄生和死亡的過程。

1.2.6 長枝木霉分生孢子懸浮液對南方根結線蟲2齡幼蟲致死和寄生作用的測定

在高溫滅菌的6孔細胞培養(yǎng)板中加入新孵化的南方根結線蟲2齡幼蟲100條／孔，然后分別向各處理中加入不同濃度長枝木霉分生孢子懸浮液（1.5×105～1.5×107個／mL）各3mL，以加入3mL無菌水作為對照，試驗共設置5個處理和1個對照，每個處理和對照重復3次，分別在（25±0.5）℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，并在24、48和72h記錄死亡的線蟲數(shù)，計算其死亡率、校正死亡率、致死中量、回歸方程、相關系數(shù)（采用最小二乘法計算其致死中量）［10］。同時在6d后，每隔2d記錄被寄生的線蟲數(shù)量，并計算其寄生率。

1.2.7 線蟲的死活鑒別

采用“體態(tài)法”和“NaOH”刺激法［9］。在體視顯微鏡下，觀察經(jīng)過不同濃度長枝木霉分生孢子懸浮液處理的2齡幼蟲活動狀態(tài)和體態(tài)。死亡的2齡幼蟲蟲體一般是僵直的，而存活的2齡幼蟲蟲體一般是彎曲的，且可以不斷地移動。然后將蟲體僵直的2齡幼蟲再次分離后置于盛有2%鹽水的培養(yǎng)皿中，在體視顯微鏡下用竹針輕輕撥動2齡幼蟲，靜止不動的即為死亡個體。

1.2.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用Excel 2003進行數(shù)據(jù)處理和表格繪制，并采用SPSS 16.0軟件進行統(tǒng)計分析。

2 結果與分析

2.1 長枝木霉分生孢子懸浮液對南方根結線蟲2齡幼蟲致死和寄生作用過程的顯微觀察

試驗結果表明，長枝木霉分生孢子懸浮液對南方根結線蟲2齡幼蟲具有較強的寄生和致死作用。鏡檢觀察到，當將新孵化的2齡幼蟲浸入長枝木霉分生孢子懸浮液時，初期2齡幼蟲活動正常。2d后大部分2齡幼蟲僵硬不動，只有少部分緩慢活動，并且有的出現(xiàn)波紋狀扭曲，然后很快僵硬不動，呈麻痹狀態(tài)。4d后鏡檢觀察，處理的2齡幼蟲基本僵硬不動，并且有些僵直不動的2齡幼蟲可以觀察到其口針（圖1－a），而對照活動正常。6d后鏡檢觀察，有的死亡蟲體顏色發(fā)生變化且有少量的分生孢子吸附或寄生于其體壁上（圖1－b）。8d后大量的分生孢子寄生并包圍在蟲體的周圍（圖1－c）；10d后鏡檢觀察，大量的分生孢子寄生于蟲體上，并萌發(fā)出大量的菌絲穿透蟲體體壁（圖1－d和圖1－e）。12d后死亡的蟲體出現(xiàn)畸形，尤其是分生孢子寄生的部位出現(xiàn)明顯的縊縮（圖1－f）；第14天鏡檢觀察，有的蟲體開始溶解，且蟲體完全變形，模糊不清（圖1－g），而對照組蟲體顏色和形態(tài)依然保持完整，無任何雜菌寄生（圖1－h(huán)）。

圖1 南方根結線蟲2齡幼蟲被長枝木霉分生孢子懸浮液處理后的形態(tài)特征Fig.1 Morphological characteristics of the second stage juveniles of M.incognitainfected by the conidial suspension of T.longibrachiatum

2.2 長枝木霉分生孢子懸浮液對2齡幼蟲的致死作用

不同濃度長枝木霉分生孢子懸浮液對2齡幼蟲具有較強的致死作用與對照相比，并且隨著長枝木霉分生孢子懸浮液濃度的增大而增大，隨著處理時間的增加而增加。尤其是在72h時濃度為1.5×107個／mL的長枝木霉分生孢子懸浮液對2齡幼蟲的死亡率和校正死亡率較高，分別為90.00%、88.81%，而對照死亡率僅為10.67%。同時由LC50值可知，24h時的LC50值大于48h，大于72h，即在72h時對2齡幼蟲的致死作用最強，48h次之，24h最差（表1）。

表1 不同濃度長枝木霉分生孢子懸浮液對南方根結線蟲2齡幼蟲的致死作用1）Table 1 Effects of different concentrations of T.longibrachiatumon the activities of the second－stage juveniles of M.incognita

2.3 長枝木霉分生孢子懸浮液對南方根結線蟲2齡幼蟲的寄生作用

與對照相比，不同濃度長枝木霉分生孢子懸浮液對2齡幼蟲的寄生率均存在顯著的差異，并且其寄生率隨著處理時間的延長而增大，隨著處理濃度的增大而增大，同時在處理后第14天濃度為1.5×107個／mL的長枝木霉分生孢子懸浮液對2齡幼蟲的寄生率高達87.33%，而對照始終沒有任何雜菌寄生（表2）。

表2 不同濃度長枝木霉分生孢子懸浮液對南方根結線蟲2齡幼蟲的寄生作用1）Table 2 Effects of different concentrations of T.longibrachiatumon parasitism of the second－stage juveniles of M.incognita

2.4 長枝木霉分生孢子懸浮液對2齡幼蟲的致死作用與2齡幼蟲的恢復

結果表明，2齡幼蟲在不同濃度長枝木霉分生孢子懸浮液中處理24和48h后基本麻痹，將其置于2%鹽水中部分可以恢復活性，并且隨著處理濃度越大和處理時間越長，恢復率越低。在不同濃度長枝木霉分生孢子懸浮液中處理72h后，基本上死亡，僅有個別的2齡幼蟲恢復活動，進而證明不同濃度長枝木霉分生孢子懸浮液具有較強的殺線蟲活性（表3）。

表3 不同濃度長枝木霉分生孢子懸浮液對2齡幼蟲的致死作用與2齡幼蟲的恢復Table 3 Effects of different concentrations of T.longibrachiatumon the activities and recovery rates of the second－stage juveniles

3 討論

根結線蟲是農作物的重要病原物之一，隨著全球氣候變暖和作物復種指數(shù)的不斷提高，根結線蟲對作物的危害愈來愈嚴重［11］。因此，根結線蟲的生物防治受到了國內外的廣泛重視，尤其利用自然界線蟲的天敵微生物防治該病害已經(jīng)成為當今線蟲學界研究的新動向和新趨勢［12］。

試驗結果表明，長枝木霉分生孢子懸浮液可作為一種新型、高效的微生物型殺線劑，對防治根結線蟲病害的發(fā)生具有廣泛的應用潛力。不同濃度長枝木霉分生孢子懸浮液對南方根結線蟲2齡幼蟲的致死和寄生作用隨著處理時間的增加而增加，隨著處理濃度的增大而增大。通過不同濃度長枝木霉分生孢子懸浮液對南方根結線蟲2齡幼蟲致死和寄生作用效果的比較，尤其是濃度為1.5×107個／mL的長枝木霉分生孢子懸浮液表現(xiàn)出較強的致死和寄生作用，可作為最佳的使用濃度應用于生產(chǎn)實踐中。目前，關于植物線蟲病害的生物防治國內外已有一些相關的報道。國內外研究和應用最多的線蟲生防菌主要有淡紫擬青霉 ［Paecilomyces lilacinus（Thom）Samson］和厚垣輪枝孢菌（Verticillium chlamydosporiumGoddard），其對控制胞囊線蟲和根結線蟲等主要植物線蟲起著十分重要的作用［13］，但已有許多臨床醫(yī)學報告表明淡紫擬青霉是一種機會性真菌，在人畜免疫力下降或免疫缺失情況下，能侵染人體或動物皮膚和組織器官［14］。同時，淡紫擬青霉通常只寄生植物線蟲的卵，侵染率與卵和真菌接觸的時間長短有關［15］。厚垣輪枝孢一般侵染線蟲的卵和雌蟲，并且在不同植物根圍的定殖能力差別較大［16］。這可能與生防菌的種類、生防菌的作用機制以及生防菌的寄主范圍等有關［17－18］。國內劉霆等［19］報道的結果與本試驗研究結果基本一致，綠色木霉發(fā)酵液原液處理后北方根結線蟲2齡幼蟲的校正死亡率為96.39%。付鵬等［20］報道生防菌劑GJ235倍、10倍稀釋液對根結線蟲2齡幼蟲的活性具有強烈的抑制作用。同時本試驗還發(fā)現(xiàn)，在較高濃度下線蟲死亡率隨作用時間的延長而增加較顯著，而在較低濃度條件下，延長作用時間殺線作用增加不明顯，可能是線蟲對長枝木霉代謝物產(chǎn)生了一定的耐受力，同時也可能是高濃度的長枝木霉分生孢子懸浮液具有一定的后效作用［21］。

另外，本試驗還首次對其作用機理進行了初步的研究，通過顯微鏡觀察其侵染的過程表明：長枝木霉在2齡幼蟲的誘導下，侵染初期分生孢子吸附或寄生于2齡幼蟲的體表，分生孢子萌發(fā)產(chǎn)生大量的菌絲穿透蟲體體壁，并且在蟲體內繁殖菌體。侵染后期長枝木霉通過產(chǎn)生某種微生物酶（幾丁質酶）或殺線活性的代謝產(chǎn)物使蟲體溶解［22］。關于木霉對致病性真菌的生防機制已有大量的報道，包括拮抗、競爭、溶菌、寄生和誘導寄主產(chǎn)生系統(tǒng)性抗性等［23］，但本試驗也證實了其對致病性線蟲也具有溶解和寄生作用。相似的報道也表明一些食線蟲真菌和細菌體外可以產(chǎn)生具有殺線活性的代謝產(chǎn)物，如淡紫擬青霉發(fā)酵液中含有一定濃度的乙酸，能夠在很大程度上抑制線蟲卵和幼蟲的生長發(fā)育［24］。而厚垣輪枝孢菌本身也可以產(chǎn)生毒素，當線蟲卵與其接觸時，便停止孵化和發(fā)育［25］。

因此，長枝木霉分生孢子懸浮液在防治植物線蟲上具有廣闊的應用前景，但目前對于長枝木霉的研究還只是處于初級階段，還有很多問題諸如其對線蟲的卵囊或胞囊、卵的寄生和致死作用及機理、對人畜及植物的安全性、持久性和針對性等有待進一步深入的研究。

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