馬源禽I型副黏病毒HN基因的克隆與序列分析

梁丹潔，歐 瑩，李春英，蔣家霞，張欣明，孫翔翔，曾詠芳，周師師，吳 軍，熊 毅

（1.廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣西南寧 530004；2.廣西區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防與控制中心，廣西南寧 530004）

禽I型副黏病毒（Avain Paramyxovirus I，APMV-I）屬于副黏病毒科，副黏病毒亞科、腮腺病毒屬，其基因組為無(wú)節(jié)段的負(fù)鏈單股RNA病毒，大小約為15kb，主要編碼6種蛋白質(zhì)[1]，其中HN蛋白在病毒脂囊膜上形成纖突，主要負(fù)責(zé)細(xì)胞受體和病毒粒子之間的結(jié)合，以破壞這種結(jié)合的拮抗作用，它還通過(guò)促使F蛋白充分接近細(xì)胞，引起病毒囊膜與細(xì)胞融合，從而進(jìn)一步啟動(dòng)感染過(guò)程[2]。有文獻(xiàn)研究表明，HN的基因突變可能導(dǎo)致具有不同致病性的APMV-I變異株的不斷產(chǎn)生，HN對(duì)毒力也有一定的影響[3]。近年來(lái)，APMV-Ⅰ宿主范圍的不斷擴(kuò)大，不僅打破了“APMV-Ⅰ不感染水禽或感染不發(fā)病”的傳統(tǒng)理論[4-5]，而且還從最初的禽類宿主到現(xiàn)在的哺乳動(dòng)物跨種間傳播，感染譜的不斷擴(kuò)大，對(duì)人類公共衛(wèi)生也存在潛在的威脅。本研究對(duì)從馬身上分離獲得M10株的HN基因進(jìn)行克隆測(cè)序，并與已發(fā)表的HN基因序列進(jìn)行同源性分析、繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹，旨在從分子生物學(xué)水平為該病的預(yù)防和控制提供理論依據(jù)，并希望能夠在分子水平上找出導(dǎo)致APMV-I病毒跨越種屬宿主改變的可能原因，從而為同源或近源跨越種屬引起人類疾病的病原體的研究提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

總RNA抽提試劑盒、Marker 2000、DH5a大腸埃希菌感受態(tài)細(xì)胞、質(zhì)粒抽提取試劑盒購(gòu)自天根公司；膠回收試劑盒、ExTaqDNA 聚合酶、M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、HIR抑制酶、dNTPs、Mgcl2、PMD18-T質(zhì)粒載體、限制性內(nèi)切酶等購(gòu)自大連寶生物有限公司。PCR反應(yīng)儀、超速離心機(jī)、移液器等。

1.2 病毒株

馬源禽I型副黏病毒M10株由廣西動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心家畜診斷科分離、鑒定。

1.3 HN基因的克隆與測(cè)序

1.3.1 引物的合成與設(shè)計(jì)

根據(jù)GenBank中已發(fā)表的鵝副黏病毒GPVSF02株全基因組序列，通過(guò)Oligo軟件設(shè)計(jì)了擴(kuò)增HN基因的2對(duì)上下游引物（表1），引物由大連寶生物Takara公司合成。將其稀釋成25 pmol/μL，-20 ℃分裝，備用。

表1 HN基因擴(kuò)增引物序列

1.3.2 病毒RNA的抽提

取病毒液按照天根公司總RNA抽提試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行抽提取RNA。

1.3.3 RT-PCR反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

將上述抽提取所得的RNA為模板，HN1、HN2下游引物為反轉(zhuǎn)錄引物，合成第一鏈cDNA。取5μL cDNA并進(jìn)行下一步PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)循環(huán)體系為：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性50 s，55 ℃退火50 s，72 ℃延伸1 min，總共38個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。反應(yīng)后的PCR產(chǎn)物可以直接進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。

1.4 目的基因的膠回收、連接、酶切鑒定以及克隆測(cè)序

膠回收按照Takara膠回收試劑盒進(jìn)行。按DNA連接試劑盒說(shuō)明書將回收純化后的目的基因與PMD18-T載體連接，置4℃過(guò)夜。然后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞DH5ɑ中，涂布于添加有Amp（100 μg/mL）的LA培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)12-16h，挑取上述生長(zhǎng)良好的白色菌落，接至含有Amp（100 μg/mL）的LB液體培養(yǎng)基，37℃搖床培養(yǎng)16 h 。取1.0-1.5 ml培養(yǎng)物提取重組質(zhì)粒，進(jìn)行雙酶切及質(zhì)粒PCR鑒定，篩選出兩者均為陽(yáng)性的菌株送大連寶生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.5 HN基因序列分析

根據(jù)M10的HN基因5’端與3’ 端cDNA的核苷酸序列測(cè)定結(jié)果，將HN基因5’端與3’端的核苷酸序列進(jìn)行拼接，并將完整的HN基因序列通過(guò)NCBI blast與GeneBank中收錄的APMV-I核苷酸序列進(jìn)行類似性檢索。用DNAStar.Lasergene.v7軟件來(lái)分析其與參考株的同源性以及構(gòu)建基因進(jìn)化樹。

2 結(jié)果

2.1 HN基因擴(kuò)增結(jié)果

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳分析表明，利用鵝副黏病毒HN基因的特異性引物擴(kuò)增出長(zhǎng)度分別為1226、1202bp左右的2條帶，與預(yù)期結(jié)果相符。

2.2 目的基因的重組質(zhì)粒鑒定結(jié)果

本毒株HN基因的2個(gè)片段重組質(zhì)粒用（Sal I和EcoRI雙酶切），可分別見(jiàn)1226bp，2650bp；1202bp，2650bp左右的兩個(gè)片段，分別為目的基因和pMD18-T載體，與預(yù)期結(jié)果相符。

2.3 馬源禽I副黏病毒HN全基因各片段的克隆和測(cè)序

篩選出陽(yáng)性克隆后進(jìn)行序列測(cè)定，運(yùn)用DNAStar軟件包中SeqMan程序?qū)λ眯蛄羞M(jìn)行拼接，該毒株HN基因約為2.0kb，ORF為1716個(gè)堿基，編碼571個(gè)氨基酸。

2.4 HN基因的編碼區(qū)序列和其推導(dǎo)的氨基酸序列同源性比較

利用DNAStar中Megalign程序?qū)10株的HN基因編碼區(qū)與從Genbank下載的基因序列進(jìn)行同源性分析比較可得：其編碼區(qū)核苷酸序列的同源性在80.9-99.2%之間。其中與雞源YG03（DQ228931.1）、NDV-03-044（GQ33831.1） 同源性最高，分別為99.2%與97.3 %；而與雞源經(jīng)典毒株B1（AF309418）、Lasota（AF077761）、強(qiáng)毒株F48E9（AY997298.1）同源性最低，分別為80.9%、81.2%、84.4%；與鴨源、鵝源、鸚鵡源、海鷗源、野鳥源相比較，同源性在91.4%～95.9%之間。而由M10株編碼區(qū)推導(dǎo)的氨基酸序列與其他毒株相比，同源性在88.6%～98.6%之間（表2）。

2.5 編碼區(qū)核苷酸序列進(jìn)化樹分析

表2 M10分離株與標(biāo)準(zhǔn)株HN基因編碼區(qū)核苷酸和氨基酸同源性比較（%）

根據(jù)HN基因的編碼區(qū)核苷酸序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹分析（圖1），從圖中可以看出M10株與雞源YG03、NDV-03-044，鴨源FP1，鵝源SF02等系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系較近，而與傳統(tǒng)經(jīng)典疫苗株Lasota、B1，經(jīng)典強(qiáng)毒株F48E9相距較遠(yuǎn)。

圖1 HN基因比較的遺傳進(jìn)化樹

2.6 HN蛋白的半胱氨酸位點(diǎn)與糖基化位點(diǎn)分析

由M10 株HN基因編碼區(qū)推導(dǎo)出的氨基酸序列可得，M10株有13個(gè)半胱氨酸殘基位點(diǎn)，分別 位 于 123、172、186、196、238、247、251、344、455、461、465、531、542位氨基酸位點(diǎn)處。

在糖基化位點(diǎn)分析上，M10株有5個(gè)保守的糖基化位點(diǎn)，分別位于115、119、341、433、508位氨基酸殘基處。

3 討論

副黏病毒HN基因預(yù)測(cè)的ORF框架長(zhǎng)度與終止密碼子的位置有差異，其翻譯出的多肽長(zhǎng)短不同，根據(jù)翻譯出的多肽長(zhǎng)度可將其分為3個(gè)型，相對(duì)應(yīng)的片段長(zhǎng)度為1713bp、1731bp以及1848bp，分別翻譯出571、577、616個(gè)氨基酸[6]。研究表明多肽為571個(gè)氨基酸時(shí)為強(qiáng)毒株[7]。廣西馬源禽I型副粘病毒M10株的HN基因約為2.0kb，ORF為1716個(gè)堿基，共編碼571個(gè)氨基酸，說(shuō)明M10株HN基因蛋白的大小具備強(qiáng)毒株特征。HN基因同源性比較以及系統(tǒng)進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)，M10株與雞源YG03、NDV-03株，鴨源FP1、鵝源SF02同源性最高，說(shuō)明這些病毒有可能來(lái)自同一祖先，而與經(jīng)典株Lasota、B1、F48E9相距甚遠(yuǎn)，說(shuō)明與過(guò)去流行的傳統(tǒng)毒株相比，M10株HN基因有了較大的變異。禽I型副粘病毒HN蛋白中的半胱氨酸（Cys）殘基、糖基化位點(diǎn)對(duì)HN蛋白的結(jié)構(gòu)功能起重要作用。國(guó)內(nèi)外已報(bào)告的APMV-I型的強(qiáng)毒株一般含有13個(gè)半胱氨酸位點(diǎn)[8]；而潛在的糖基化位點(diǎn)有6個(gè)，一般在119、341、433、481、508及538位，前4個(gè)可以被糖基化，而后兩個(gè)不用于糖基化[9]。據(jù)報(bào)道，一些國(guó)內(nèi)的APMV-I分離株缺少第538位的糖基化位點(diǎn)[10]。本研究的M10株HN基因含有13個(gè)半胱氨酸位點(diǎn)，與國(guó)內(nèi)外毒株相比較，其數(shù)目和位置相對(duì)保守，糖基化位點(diǎn)有5個(gè)，第538-540位無(wú)糖基化位點(diǎn)特征，但是，這并不影響HN蛋白的結(jié)構(gòu)特征。

近年來(lái)，禽I型副黏病毒的宿主范圍變得越來(lái)越廣泛，迄今已知能自然或人工感染的鳥類超過(guò)205多種，世界各地相繼從豬、甚至人體內(nèi)也分離到了禽I型副黏病毒[11-13]。出現(xiàn)這種情況與不健全的飼養(yǎng)模式有密切關(guān)系，家禽與家畜混養(yǎng)，飼養(yǎng)場(chǎng)地消毒不徹底，禽畜市場(chǎng)管理不嚴(yán)格等情況都有可能使得APMV-I病毒在家禽、家畜、人之間傳播；另外，南方屬于全球候鳥的遷徙線路上，有學(xué)者預(yù)測(cè)，鴿子、八哥等野生鳥類活動(dòng)廣泛，喜歡啄食豬背部蜱、蚊蟲等，是豬感染APMV-I的可能途徑之一[14]。而從人體分離到的新城疫病毒與先前在歐洲與北美從鴿子身上分離到的新城疫病毒有較高的同源性，并且具有強(qiáng)毒株的特點(diǎn)，可以考慮，鴿也可能是人類新城疫病毒的主要來(lái)源[15]。由此可推斷，APMV-I也有可能通過(guò)以上途徑傳播至馬身上并發(fā)生變異。越來(lái)越多的數(shù)據(jù)表明，APMA-I的宿主范圍在不斷的擴(kuò)大，給人類健康帶來(lái)了不可忽視的影響，因此加強(qiáng)APMA-I的分子流行病學(xué)調(diào)查，以及不同宿主源性APMA-I毒株演化分析具有重大意義。

[1]B w卡爾尼克．禽病學(xué)[M]．9版 高福，劉文軍，譯．北京：北京農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，1991，427-429．

[2]Sakaguchi T，Toyoda T，Gotoh B，et a1．Newcastle disease virus evolution I．Multiple lineages defined by sequence variability of the hemagglutinin—neuraminidase gene[J]．Virol，1989，169（2）：260-272．

[3]劉華雷，王永坤，嚴(yán)維巍，等.禽副粘病毒I型（APMV-1）分子生物學(xué)研究進(jìn)展[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2001，22（1）：16-21.

[4]潘群興，王永山，楊建朋，等．新城疫不同宿主源分離株的生物學(xué)特性[J]．江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2011，27（6）：1325-1329.

[5]Abolnik C，Gerdes G H， Kitching J，et al.Characterization of pigeon paramyxoviruses （Newcastle disease virus） isolated in South Africa from 2001 to 2006.[J]Onderstepoort J Vet，2008，75（2）：147-152.

[6]Mc Ginnes L W，Wilde A， Morrison T G.Nucleotide sequence of the gene encoding the Newcastle disease virus haemagglutin and comparisons of paramyxovirus HN protein sequence[J]Virus Res，1987，7（3）：187-202．

[7]云濤，何永強(qiáng)，劉光清，等，鴨I型禽副粘病毒YH99V株HN基因的克隆和序列分析.[J].中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2006，28（6）：664-667.

[8]McGinnes L W，Wilde A.The role of the individual cysteine residues in the formation of the mature，antigenic HN protein of Newcastle disease virus［J ]Virol，1994 ，200（2）：470 -483 .

[9]McGinnes L W，Monison T G.Disul fi de bond formation is a determinat of glycosylation site usage in the hemaggltuininneuraminidase glycoportein of Newcastle disease virus [J].Virol， 1997，71（4）：3083-3089.

[10]肖躍強(qiáng)，楊春富，管宇，等.鵝副黏病毒BZ02株F HN基因的克隆及分子特性分析[J]中國(guó)獸醫(yī)雜志2009，45（6）：14-17.

[11]劉海霞，敖艷華.幾株野生鳥類來(lái)源的I型禽副粘病毒分子生物學(xué)特征的研究[J].中國(guó)獸藥雜志， 2008，42（6）：12-15.

[12]馮淑萍.廣西豬源副粘病毒GuangXi株全基因的測(cè)序分析與生物學(xué)特性研究[D].廣西大學(xué)碩士論文，2010.

[13]Goebei S J，Taylor J，Barr B C，et a1．Isolation of avian paramyxovirus I from a patient with a lethal case of pneumonia[J]．J Virol，2007，81（22）：12709-12714．

[14]魯會(huì)軍，金寧一，金擴(kuò)世．豬副粘病毒的研究進(jìn)展[A].中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)家畜傳染病分會(huì)成立20周年慶典暨第十次學(xué)術(shù)研討會(huì)討論文集[C]．杭州：中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)禽病學(xué)分會(huì)，2000，323-326．

[15]Ujvari D E，Wehmann E Kaleta F，et a1． Phylogenetic analysis reveals extensive evolution of avian paramyxovirus type I strains of pigeons（Columba livia）and suggests multiple species transmission[J]．Virus Res，2003，96（1）：63-73．