人血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的生物信息學(xué)分析

梁 丕（廣東省信宜人民醫(yī)院心內(nèi)科，廣東 信宜 525300）

血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF），又稱(chēng)血管通透因子（Vascular permeability factor，VPF）或血管調(diào)理素（Vasculotropin），是1989年Ferrara等從牛垂體濾泡星狀細(xì)胞培養(yǎng)液中分離純化的糖類(lèi)蛋白質(zhì)，后來(lái)在鼠垂體前葉腫瘤細(xì)胞系、鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞、豚鼠瘤、人單核細(xì)胞等細(xì)胞培養(yǎng)液中也純化出了VEGF蛋白[1]。VEGF是一個(gè)具有高度保守性，由兩個(gè)相同亞基（Mr 23 000）以二硫鍵交聯(lián)結(jié)合成的二聚體糖蛋白，主要作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞[2-3]。VEGF由某些腫瘤細(xì)胞分泌，通過(guò)與血管內(nèi)皮上的相應(yīng)受體結(jié)合促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖，同時(shí)可增加血管通透性使內(nèi)皮細(xì)胞遷移，誘導(dǎo)腫瘤血管生成，維持腫瘤的繼續(xù)生長(zhǎng)，是目前發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)烈的血管生成因子，與腫瘤及非腫瘤的血管新生病理過(guò)程中密切相關(guān)，其與轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF-β）、血小板源性生長(zhǎng)因子（PDGF）、NO及一些重金屬離子有關(guān)，還受缺血和缺氧環(huán)境的調(diào)節(jié)[4]。目前VEGF基因已先后從人、野豬、綿羊等多種動(dòng)物中克隆出來(lái)，并通過(guò)分子遺傳學(xué)方法證明了該基因在血管生成、重構(gòu)、病變等過(guò)程中的重要作用，因此對(duì)VEGF的研究成為當(dāng)前的熱點(diǎn)課題。本文利用生物信息學(xué)工具和方法，以人VEGF分析為重點(diǎn)，對(duì)動(dòng)物VEGF的核苷酸和氨基酸序列的特征，及其編碼蛋白的理化性質(zhì)、分子結(jié)構(gòu)、生化功能和系統(tǒng)演化等進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，以期為深入探討VEGF蛋白的酶學(xué)特性和血管生成的分子機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 臨床資料

VEGF的核苷酸和氨基酸序列來(lái)源于NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)，其中人VEGF的登錄號(hào)依次為：GenBank Accession No.AY047581，GenPept accession no.AAK95847。

利用Vector NTI Suit 8、Clustal X、MEGA4.1β、Accelrys ViewerLite 5.0軟件和www.ncbi.nlm.nih.gov、www.expasy.org等網(wǎng)站提供的各種在線(xiàn)生物信息學(xué)工具進(jìn)行預(yù)測(cè)和分析。核酸及氨基酸序列的分子結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)分析、開(kāi)放閱讀框的查找和翻譯使用Vector NTI Suit 8和Protparam軟件完成；核酸及氨基酸序列的同源性比對(duì)使用Clustal X軟件和NCBI上的Blast在線(xiàn)工具進(jìn)行；分子系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)使用MEGA3的Phylogeny中的Neighbor-Joining方法構(gòu)建；蛋白質(zhì)的功能結(jié)構(gòu)域和三級(jí)建模分別用CDD和SWISSMODEL分析。

2 結(jié)果

2.1 人VEGF基因的核酸及其編碼蛋白的序列特征和理化性質(zhì)：NCBI上登錄的人VEGF核苷酸序列全長(zhǎng)640 bp，包括3'-UTR（Untranslated Regions，非翻譯區(qū)）、ORF（Open Reading Frame，開(kāi)放閱讀框）和5'-UTR序列，且編碼區(qū)的起始密碼子為ATG，終止密碼子為T(mén)GA。用Protparam預(yù)測(cè)VEGF編碼蛋白的理化性質(zhì)，推測(cè)該蛋白的分子式為C960H1504N288O281S23，分子量為22.3136 kDa，等電點(diǎn)pI=7.88，摩爾消光系數(shù)為24 950，半衰期為30 h，脂肪酸系數(shù)60.73，總的親水性平均系數(shù)（Grand average of hydropathicity，GRAVY）為－0.704，推論該蛋白屬于疏水性蛋白，而不穩(wěn)定參數(shù)為56.69，故屬不穩(wěn)定蛋白。該基因相應(yīng)的氨基酸殘基數(shù)為191，所含氨基酸組成見(jiàn)表1，含Cys和Glu最多，不含Pyl和Sec。

表1 人VEGF蛋白的氨基酸組成

2.2 人VEGF蛋白的氨基酸序列的比對(duì)分析：選取人等7條動(dòng)物VEGF氨基酸序列，在Vector NTI 8軟件中進(jìn)行多重比對(duì)分析。分析結(jié)果用不同顏色顯示，見(jiàn)圖1，顏色越深的表示同源性越高，最深的區(qū)域則表示可能存在的重要功能域。分析結(jié)果顯示動(dòng)物VEGF具有很高的同源性，一致性達(dá)到43.5%，可見(jiàn)VEGF編碼區(qū)高度保守。而其中僅原雞的變異性較大，則提示禽類(lèi)與哺乳動(dòng)物的VEGF之間存在差異，這一方面說(shuō)明VEGF在物種進(jìn)化過(guò)程具有重要意義，另一方面也推測(cè)這可能是由于動(dòng)物血管生成的機(jī)制存在很強(qiáng)的相似性，而作為與血管發(fā)生密切相關(guān)的VEGF蛋白必須保持足夠的遺傳穩(wěn)定性和演化趨同性。

圖1 來(lái)自不同動(dòng)物VEGF氨基酸序列多重比對(duì)

2.3 人VEGF蛋白的氨基酸序列的分子系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析：將7條動(dòng)物VEGF蛋白氨基酸序列在Clustal X軟件中進(jìn)行完全比對(duì)后，在MEGA4.1軟件中依據(jù)NJ（Neighbor-Joining）方案進(jìn)行構(gòu)建分子進(jìn)化樹(shù)[5-6]。獲得VEGF氨基酸序列的分子進(jìn)化樹(shù)分析結(jié)果見(jiàn)圖2。7種動(dòng)物的VEGF氨基酸序列聚成4支：人與野豬聚成第一支；綿羊和藏羚羊聚成第二支；鼴鼠和小鼠聚成第三支，而原雞則獨(dú)立一支。該進(jìn)化樹(shù)很好地反映出了這7種不同動(dòng)物之間的親緣關(guān)系，如人與豬同屬較高等的哺乳動(dòng)物，聚為一支，綿羊與藏羚羊同屬羊亞科也聚為一支，鼴鼠和小鼠為鼠總科的嚙齒類(lèi)動(dòng)物，原雞則因其屬非哺乳的禽類(lèi)而單獨(dú)成支。由此可見(jiàn)，依據(jù)氨基酸序列構(gòu)建的分子進(jìn)化樹(shù)能在一定程度上反映不同動(dòng)物之間的系統(tǒng)分類(lèi)學(xué)關(guān)系和自然演化進(jìn)程，其結(jié)果對(duì)于明確判斷物種間的親緣關(guān)系能提供一定的參考。

圖2 基于MEGA4.1中NJ方法的人和其他物種的VEGF分子進(jìn)化樹(shù)聚類(lèi)分析

2.4 人VEGF編碼蛋白的功能結(jié)構(gòu)域和三維建模分析：蛋白質(zhì)由多個(gè)基序組成，且基序相應(yīng)的氨基酸區(qū)段行使特異的生化功能，同時(shí)也蘊(yùn)含著各自的遺傳進(jìn)化信息。利用CDD在線(xiàn)工具分析人VEGF氨基酸序列的功能結(jié)構(gòu)域，即去掉信號(hào)肽，剩下的成熟肽氨基酸序列包含一個(gè)PDGF超家族功能域，見(jiàn)圖3[7]。表明人VEGF編碼蛋白屬于血小板衍生因子（Platelet-derived growth factor，PDGF）超家族，同樣屬于一種重要的促有絲分裂因子，具有刺激特定細(xì)胞群分裂增殖的能力，在血管生成和重構(gòu)機(jī)制中具有關(guān)鍵作用。將這條人VEGF氨基酸序列上傳至SWISS-MODEL服務(wù)器中進(jìn)行基于同源性的三維建模，然后在ViewerLite 4.2軟件中進(jìn)行序列編輯，獲得人VEGF的三級(jí)結(jié)構(gòu)模型，見(jiàn)圖4[8-9]。

圖3 人VEGF的保守結(jié)構(gòu)域分析

圖4 人VEGF基因編碼蛋白的三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

3 討論

VEGF作為血管生成和重構(gòu)的關(guān)鍵因子而倍受關(guān)注，依托于生物學(xué)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)與現(xiàn)代計(jì)算技術(shù)相結(jié)合的生物信息學(xué)已經(jīng)成為后基因組時(shí)代的重要方法和前沿領(lǐng)域[10]。本文應(yīng)用生物信息學(xué)方法對(duì)人VEGF基因的核苷酸及其編碼蛋白質(zhì)序列進(jìn)行了比對(duì)、分析和建模，進(jìn)而對(duì)其分子結(jié)構(gòu)和生化功能進(jìn)行了預(yù)測(cè)分析，結(jié)果表明該基因的核苷酸序列包括3'-UTR、ORF和5'-UTR，推測(cè)其編碼蛋白分子式為C960H1504N288O281S23，是含有PDGF重要功能域親水性不穩(wěn)定蛋白質(zhì)，其在動(dòng)物系統(tǒng)進(jìn)化過(guò)程中可能具有重要作用，且三維結(jié)構(gòu)建模成功。本研究結(jié)果可為深入開(kāi)展人VEGF蛋白的生化特性和血管生成的分子機(jī)制研究提供重要理論參考，有利于推動(dòng)桑等腫瘤學(xué)和心血管病學(xué)的發(fā)展。

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