組織因子途徑抑制物-2在宮頸癌中表達(dá)情況的研究分析

孟斐

宮頸癌是全世界婦女中僅次于乳腺癌導(dǎo)致婦女死亡的第二大惡性腫瘤，在中國(guó)女性中發(fā)病率居第一位。宮頸癌的形成是一個(gè)漸進(jìn)的變化過(guò)程，一般要經(jīng)過(guò)鱗狀上皮不典型增生、原位癌發(fā)展到浸潤(rùn)癌，其主要特點(diǎn)是早期蔓延。目前對(duì)宮頸癌的治療包括手術(shù)、放療、化療等，但仍有大量的患者復(fù)發(fā)而死亡，因此隨著對(duì)腫瘤發(fā)生發(fā)展分子機(jī)制研究的不斷深入，惡性腫瘤的基因治療已成為當(dāng)前腫瘤研究的熱點(diǎn)。組織因子途徑抑制物-2(Tissue factor pathway inhibitor2，TFPI-2)，最初從胎盤組織中分離出來(lái)，又稱胎盤蛋白-5(placental protein 5，PP5)。目前來(lái)說(shuō)TFPI-2在生理、病理中的作用還沒(méi)有準(zhǔn)確完整結(jié)論，但在許多方面已經(jīng)有了使人感興趣的進(jìn)展，已有研究發(fā)現(xiàn)，在許多類型的人類腫瘤細(xì)胞中，如胃癌［1］，結(jié)腸癌［2］，前列腺癌［3］等，都存在編碼TFPI-2基因的抑制及缺失，值得進(jìn)一步的研究。本文主要檢測(cè)TFPI-2在宮頸癌中的表達(dá)情況，現(xiàn)分析報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2010年1月至2011年1月在沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院奉天醫(yī)院婦產(chǎn)科門診及住院患者手術(shù)切除標(biāo)本共115例，臨床資料完整?；颊吣挲g范圍26～71歲，中位年齡(45.5士2.3)歲。其中宮頸癌50例，CIN50例和婦科疾病行子宮切除術(shù)的正常宮頸標(biāo)本15例。宮頸癌分期采用FIGO2000年的臨床分期標(biāo)準(zhǔn)，組織病理分級(jí)按FIGO分級(jí)方法評(píng)定。3組患者一般資料比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，具有可比性。

1.2 方法 ①石蠟切片在病理科完成。②常規(guī)脫蠟水化:二甲苯20min，3次:100%酒精3次，各10min:98%酒精10 min;80%酒精10min:70%酒精10min。③蒸餾水沖洗，PBS洗5min×3次。④熱修復(fù)抗原:切片浸入0.01M構(gòu)椽酸緩沖液，微波爐加熱至沸騰后斷電，間隔5min，反復(fù)兩次。室溫冷卻。⑤PBS洗5min×3次。⑥3%H2O237℃孵育20min，以阻斷內(nèi)源性酶活性。⑦ PBS洗5min×3。⑧滴加A試劑山羊血清室溫15min。⑨除去多余液體，不洗。⑩實(shí)驗(yàn)組加入一抗抗體((TFPI-2工作濃度分別為1∶160)，對(duì)照組用PBS代替一抗，4℃濕盒過(guò)夜。?取出濕盒，復(fù)溫后PBS洗5min×3次。?滴加試劑 B生物素化二抗工作液 IgG37℃15 min，PBS洗5min×3次。?滴加試劑C辣根標(biāo)記鏈霉卵白素工作液37℃ 15min，PBS 洗5min ×3 次。?DAB(棕色)顯色，1.5ml蒸餾水中加入試劑盒中A，B，C試劑各一滴，混勻后加至切片，室溫顯色，鏡下控制染色程度。?蘇木素復(fù)染15～30s，清水沖洗，返藍(lán)。?系列脫水:70%酒精5min，80%酒精5min，98%酒精5min，100%酒精5min×3，二甲苯5 min×3。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS13.0軟件包進(jìn)行分析。檢測(cè)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，兩組間比較進(jìn)行t檢驗(yàn)，當(dāng)P＜0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TFPI-2在不同宮頸組織中的表達(dá) 正常宮頸組織、宮頸上皮內(nèi)瘤變(CIN)和宮頸癌中TFPI-2表達(dá)逐漸降低，三者間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，見表1。

2.2 TFPI-2表達(dá)與宮頸癌臨床病理關(guān)系 宮頸癌組織中TFPI-2表達(dá)水平與宮頸癌的FIGO分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。但是與宮頸癌的分化程度及病理類型之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見表2。

表1 TFPI-2在不同宮頸組織中的表達(dá)

表2 TFPI-2在不同宮頸組織中的表達(dá)

3 討論

組織因子途徑抑制物-2(Tissuefactorpathwayinhibitor2，TFPI-2)，最初從胎盤組織中分離出來(lái)，又稱胎盤蛋白-5(placentalprotein5，PP5)。定位于7號(hào)染色體，確切位置是7q22，體內(nèi)主要以相對(duì)分子質(zhì)量為32000的形式存在于內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)中。TFPI-2分子共由5個(gè)部分組成，即富含酸性氨基酸的N端、3個(gè)首尾相連的Kunitz結(jié)構(gòu)域和富含堿性氨基酸的C端。TFPI-2通過(guò)Kunitz結(jié)構(gòu)域?qū)Φ鞍姿饷高M(jìn)行抑制，主要是KD1結(jié)構(gòu)域和P1殘基與蛋白水解酶的蛋白袋結(jié)構(gòu)(主要是精氨酸和賴氨酸殘端)結(jié)合來(lái)抑制其活性。KD1的三維結(jié)構(gòu)是典型的Kuntiz蛋白酶抑制劑折疊結(jié)構(gòu)，其核心區(qū)域含有抑制多種絲氨酸蛋白酶的結(jié)構(gòu)元件。反應(yīng)活性部位的P1殘基(Arg224)與纖溶酶等多種絲氨酸蛋白酶活性位點(diǎn)結(jié)合，從而直接抑制酶的作用［4］。TFPI-2屬于庫(kù)尼(Kunitz)型絲氨酸蛋白酶抑制劑家族蛋白，是一種廣譜的絲氨酸蛋白酶抑制物，在體外可強(qiáng)烈抑制纖溶酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶、血漿激肽釋放酶、FXa及基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)等［5］。因此可能與組織發(fā)生、胚胎發(fā)育分化、傷口愈合、纖溶以及腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移等生理和病理過(guò)程有關(guān)。

目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于TFPI-2在宮頸癌中的研究并不多見，華盛頓大學(xué)的Pavel等［6］在235個(gè)基因中篩選宮頸癌甲基化基因，研究發(fā)現(xiàn)TFPI-2在宮頸癌組織及宮頸癌細(xì)胞株HeLa、Si-Ha、CaSki中存在高甲基化狀態(tài)，利用5-雜氮2-脫氧核苷酸(5-aza-2'-deoxyc-ytidine，DAC)解除甲基化后，TFPI-2可以恢復(fù)表達(dá)。由此推測(cè)TFPI-2失活可能與宮頸癌的侵襲、轉(zhuǎn)移有關(guān)，但是目前關(guān)于TFPI-2對(duì)宮頸癌細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移能力影響的相關(guān)研究尚未見報(bào)道，因此尚有待進(jìn)一步研究證實(shí)。

本組資料中我們采用免疫組化法對(duì)宮頸癌、CIN及正常宮頸上皮中TFPI-2的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，該基因主要表達(dá)在正常宮頸上皮細(xì)胞以及癌細(xì)胞中，在宮頸癌中的表達(dá)以陰性和弱陽(yáng)性為主，在正常宮頸組織中主要以強(qiáng)陽(yáng)性為主，在C1N中的表達(dá)介于宮頸癌和正常宮頸上皮組織之間，三者間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示宮頸癌中存在TFPI-2表達(dá)下降及缺失，TFPI-2的表達(dá)水平隨著宮頸病變的進(jìn)展呈下降趨勢(shì)，因此推測(cè)，TFPI-2的表達(dá)下調(diào)在正常宮頸上皮進(jìn)展為宮頸癌癌前病變甚至宮頸癌的過(guò)程中起著一定的作用。

此外，我們進(jìn)一步分析了TFPI-2的表達(dá)與宮頸癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)其表達(dá)的下降趨勢(shì)與宮頸癌FIGO分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。表明腫瘤越晚期，TFPI-2表達(dá)水平越低，提示TFPI-2表達(dá)降低可能與宮頸癌的不良預(yù)后相關(guān)。我們推測(cè)TFPI-2的低表達(dá)在宮頸癌的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。

［1］Takada H，Wakabayashi N，Dohi O，et al.Tissue factor pathwayinhibitor 2(TFPI2)is frequently silenced by aberrant promoter hypermethylation in gastric cance.Cancer Genet Cytogenet，2010，197(1):16-24.

［2］Ribarska T，Ingenwerth M，Goering W，et al.Epigenetic inactivation of the placentally imprinted tumor suppressor gene TFPI2 in prostate carcinoma.Cancer Genomics Proteomics，2010，7(2):51-60.

［3］Gl?ckner SC，Dhir M，Yi JM，et al.Methylation of TFPI2 in stool DNA:a potential novel biomarker for the detection of colorectal cancer.Cancer Res，2009;69(11):4691-9.

［4］Chand HS，Schmidt AE，Bajaj SPet al.Structure function analysis of the reacti-ve site in the first Kunitz type domain of human tissue factor pathway inhibitor-2.Biol Chem，2004，279(17):17500-7.

［5］Du X，Chand H S，Kisiel W.Human tissue factor pathway inhibitor-2 does not bind or inhibit activated matrix met alloproteinase-1.Biochim Biophys Acta，2003，1621(3):242-245.

［6］Pavel S，Qinghua F，Gary G，et al.Discovery of Novel Methylation Biomarkers in Cervical Carcinoma by Global Demethylation and Microarray Analysis.Cancer Epidemiol Biomarkers Prev，2006;15(1):114-23.