洋鐵酸模中蒽醌類物質(zhì)的提取技術(shù)分析

劉治林

【摘 要】目的探索高效、簡捷的蒽醌成分提取方法。方法甲醇-超聲法提取洋鐵酸模中的蒽醌類物質(zhì)，超聲加熱后再重新冷卻處理；HPLC-MS檢測提取物，并與乙醇提取法進(jìn)行比較。結(jié)果甲醇-超聲抽提法更有利于提取洋鐵酸模中的蒽醌類物質(zhì)，其提取效率是乙醇抽提法的6倍。結(jié)論甲醇-超聲抽提法可以高效提取洋鐵酸模蒽醌成分。

【關(guān)鍵詞】蒽醌；洋鐵酸模；提取

洋鐵酸模Rumex patientia L，蓼科酸模屬植物，其主要活性成分為蒽醌類物質(zhì)，包括大黃素，大黃酚，大黃素甲醚及其苷類衍生物。

洋鐵酸模中蒽醌類物質(zhì)的提取通常采用乙醇作為抽提溶劑，但是不能獲得較純的蒽醌類物質(zhì)，乙醇提取物形成浸膏不易萃取、分餾等操作，給蒽醌類成分的純化帶來困難。文獻(xiàn)報(bào)道采用甲醇為抽提溶劑提取尼泊爾酸模（Rumex.C）中蒽醌類物質(zhì)，雜質(zhì)較少，且苷類成分提取率較高。本文采用甲醇抽提洋鐵酸模中蒽醌類物質(zhì)，并用HPLC-MS檢測蒽醌類含量。由于蒽醌苷類物質(zhì)衍生物比較多，HPLC-MS法沒有用來可以跟蹤檢測的離子對，故本研究用酸將提取物完全水解成游離蒽醌，通過測定水解前后游離蒽醌的含量差值計(jì)算出蒽醌苷類的含量，并與乙醇抽提法比較，旨在尋找一種高效、簡捷的蒽醌成分提取方法。

1.儀器與材料

洋鐵酸模，當(dāng)年9月份采自長春。大黃素、大黃素甲醚、大黃酚標(biāo)準(zhǔn)品，由長春藥檢所提供。其他試劑均為國產(chǎn)化學(xué)純。

250DE超聲儀（上海昆山超聲儀器公司），RE52旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海滬西分析儀器廠），C18柱46mm×150mm（美國AB公司），api4000高效液相四級桿串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國AB 公司）。

2.方法

（1）甲醇-超聲抽提法取400g洋鐵酸模干粉以 4∶1的質(zhì)量比加入甲醇溶劑，60℃超聲30min，重復(fù)3次。將甲醇抽提液60℃減壓蒸干。少甲醇溶解提取物，抽提液再次減壓蒸干。80℃恒重2h，收集干粉為12g。

（2）乙醇抽提法用80%的乙醇提取20kg洋鐵酸模根干粉，質(zhì)量體積比為5∶1過夜，重復(fù)3次。將乙醇抽提液60℃減壓蒸干。80℃恒重2h，收集浸膏狀物質(zhì)為120g。

（3）蒽醌苷水解產(chǎn)物制備。

甲醇-超聲提取物與乙醇提取物各3.00g，加入50ml的2mol/L的HCl，加熱冷凝回流2h。收集水解產(chǎn)物，60℃干燥。

（4）3種蒽醌類物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作大黃素8.6mg、大黃酚7.7mg、大黃素甲醚9.2mg，選用1∶1的甲醇氯仿定溶到10ml，再逐級稀釋到3，1，500，200，100μg·ml-1。其中大黃素濃度選用0.3，0.2，50，20，10μg·ml-1。峰面積對濃度作圖，得標(biāo)準(zhǔn)曲線。

（5）色譜和質(zhì)譜條件的選擇。

色譜條件甲醇∶乙酸銨∶甲酸=90∶10∶0.1，流速0.8ml·min-1。

質(zhì)譜條件大黃酚：（Q1/Q2）252.8/224.9，分解能DP-60V，碰撞能CE-27V；大黃素：（Q1/Q2）269.0/225.1，分解能DP-25V，碰撞能CE-28V；大黃素甲醚：（Q1/Q2）283.0/240.0，分解能DP-50V，碰撞能CE-30V。不同濃度的溶液進(jìn)色譜進(jìn)行液質(zhì)聯(lián)用分析，上柱時(shí)間10min。

3種組份同時(shí)進(jìn)樣，有較好的跨度，分離條件合理。同濃度下大黃素甲醚的響應(yīng)值偏小，大黃素的檢測限是其他兩種的10倍左右。

3.結(jié)果與討論

（1）蒽醌標(biāo)準(zhǔn)品的工作曲線制作及濃度檢測將峰面積Y對濃度X作圖，經(jīng)過spss11.0處理，得3條工作曲線的方程。

大黃素：Y（峰面積），X（濃度）（m/z283.0/240.1）：Y=2159.98X+20668.25（r=0.9996）；大黃酚：Y（峰面積），X（濃度）（m/z252.8/224.9）：Y=43X+-2.03e+003（r=0.9965）；大黃素甲醚：Y（峰面積），X（濃度）（m/z283.0/240.1）：Y=20.5X+-921（r=0.9981）。其中大黃素濃度在0.3～10ng/ml之間時(shí)具有較好的線性關(guān)系；大黃酚和大黃素甲醚在3～100ng/ml時(shí)有良好的線性關(guān)系。3條標(biāo)準(zhǔn)曲線R>0.99值均接近1，可以用來作為工作曲線。兩種方法提取3種游離蒽醌的抽提率比較。兩種抽提方法分別為甲醇超聲法（methanol-ultrasonic）和乙醇提取法（ethanol exraction）。苷類通常在經(jīng)過1h酸水解后，會完全轉(zhuǎn)化為苷元。而本試驗(yàn)選用2h酸水解，以確保其完全水解。水解后蒽醌濃度減去水解前的蒽醌濃度得到的蒽醌苷類的提取率。兩種方法提取3種游離蒽醌的抽提率比較。

（2）游離蒽醌和蒽醌苷類提取方法的比較，兩種方法游離蒽醌提取率的柱狀分析圖，縱坐標(biāo)為提取率，橫坐標(biāo)為提取方法。3種游離蒽醌在甲醇超聲提取法中的提取率都高于乙醇提取法，總提取率是后者4倍。在甲醇超聲提取法中大黃素是大黃酚和大黃素甲醚的3倍，說明洋鐵酸模的游離蒽醌主要以大黃素的方式存在。

蒽醌苷類提取率的柱狀圖比較，縱坐標(biāo)為提取率，橫坐標(biāo)為提取方法。可見甲醇-超聲提取法在3種蒽醌苷類組分的提取率高于乙醇提取法6倍。

甲醇-超聲提取法的蒽醌苷類含量也高于乙醇提取法，其中大黃酚的含量高于大黃素和大黃素甲醚。這說明在蒽醌苷類物質(zhì)中，大黃酚苷是主要的存在方式。在游離形態(tài)下，蒽醌類物質(zhì)更多的以大黃素存在；在結(jié)合形態(tài)下，蒽醌類物質(zhì)以大黃酚的形態(tài)存在。以上兩點(diǎn)可以說明，在洋鐵酸模根中，大黃素溶解度較好，具有兩個(gè)羥基，可以更穩(wěn)定的存在，而最終的產(chǎn)物是大黃酚苷。大黃素甲醚無論何種情況下含量都很少，說明大黃素甲醚是一種次級代謝產(chǎn)物的中間體。以上結(jié)果還表明，蒽醌苷類的含量要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于游離蒽醌的含量，證明洋鐵酸模中蒽醌類物質(zhì)主要以苷類的方式存在。

（3）HPLC-MS法在蒽醌類物質(zhì)提取時(shí)的可靠性和適用性液質(zhì)聯(lián)用法對于游離蒽醌的跟蹤檢測比普通高效液相法具有優(yōu)勢。蒽醌類和蒽醌苷類因?yàn)榫哂邢嗤纳珗F(tuán)而有近似的紫外吸收光譜，因而單高效液相法會產(chǎn)生較大的誤差。蒽醌苷衍生物較多，糖鏈連接方式和長度都難以確定，因此將蒽醌苷類水解成相應(yīng)的游離物再進(jìn)行液質(zhì)法跟蹤檢測能準(zhǔn)確得到蒽醌苷類的物質(zhì)含量。

此外，通過液質(zhì)聯(lián)用方法檢測蒽醌類物質(zhì)的含量可以更加簡化研究的方法，精確度更高，檢測限更低，能夠達(dá)到10-9g，傳統(tǒng)高效液相檢測法的不足是物質(zhì)衍生物容易出現(xiàn)紫外干擾，蒽醌類物質(zhì)的紫外吸收峰多在一起，且保留時(shí)間由于化學(xué)結(jié)構(gòu)的接近而分離較窄。通過液質(zhì)聯(lián)用法可以對專一的離子對進(jìn)行分析，不受紫外吸收雜峰的干擾，這是單一的高效液相系統(tǒng)不能達(dá)到的。

本研究選用甲醇超聲法，得到的產(chǎn)物為干粉狀物質(zhì)，對照乙醇抽提法的到的浸膏狀物質(zhì)有利于進(jìn)一步的分級提取。并且甲醇-超聲抽法提取率高，能夠充分利用羊蹄植物資源，為今后的羊蹄類植物開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

【參考文獻(xiàn)】

[1]張逢春，劉成柏，吳宗澤，齊曉娟，陳霞.甲醇-超聲法提取洋鐵酸模有效成分的研究.論文網(wǎng)，2011，04.