半乳凝素-3在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)及相關(guān)性研究

劉美燕 杜冰 李春紅 趙艷濱 孟慶威 蔡莉

半乳凝素-3（Galectin-3）能與β-半乳糖苷特異性結(jié)合，參與許多生理和病理過(guò)程，在調(diào)解機(jī)體免疫、細(xì)胞粘附、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡、血管侵襲等諸多方面起著重要的作用[1]，且與腫瘤的轉(zhuǎn)移及預(yù)后有關(guān)。目前，在許多惡性腫瘤中都發(fā)現(xiàn)了Galectin-3的表達(dá)，但在不同的腫瘤中，Galectin-3的表達(dá)水平不同。在肺癌中的研究比較少。

本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用免疫組化法和RT-PCR方法，結(jié)合完整的臨床資料檢測(cè)Galectin-3在非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）中的表達(dá)，分析Galectin-3的表達(dá)與NSCLC發(fā)生發(fā)展的關(guān)系，并探討其表達(dá)與臨床病理特征之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料 17例正常肺組織取于哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院2006年10月-2007年2月液氮凍存組織，52例NSCLC組織標(biāo)本取自哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院2006年1月-2007年5月手術(shù)切除病理存檔蠟塊，52例組織均有良好隨訪記錄（＞50個(gè)月），所有手術(shù)患者術(shù)前均未接受過(guò)放療、化療，診斷均經(jīng)常規(guī)病理切片證實(shí)。組織均經(jīng)甲醛固定，石蠟包埋，厚4 μm連續(xù)切片，分別作HE和免疫組化染色。10例NSCLC組織為哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院2006年11月-2007年2月手術(shù)切除的新鮮肺癌組織，所有原發(fā)腫瘤標(biāo)本在切除后被立即分成兩部分：一部分經(jīng)甲醛固定、石蠟包埋用于免疫組化檢測(cè)，另一部分儲(chǔ)存于液氮中用于RT-PCR檢測(cè)。

1.2 臨床及病理資料 62例NSCLC按國(guó)際抗癌聯(lián)盟2009年修訂的TNM分期標(biāo)準(zhǔn)分為：Ia期-IIb期29例，IIIa期-IIIb期33例；根據(jù)2011年WHO公布的肺癌組織分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)判定病理類(lèi)型和分化程度。肺腺癌32例，肺鱗癌30例；高分化24例，中分化17例，低分化21例；男性34例，女性28例；年齡從35歲-79歲，中位年齡為57.1歲。10例新鮮非小細(xì)胞肺癌組織中鱗癌6例，腺癌4例。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑與方法

1.3.1 S-P法 一抗Galectin-3（NCL-GAL3）鼠單抗為Santa Cruz公司產(chǎn)品， UltrasensitiveTMS-P免疫組織化學(xué)染色試劑盒購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)公司。DAB顯色劑購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)公司。免疫組化染色程序按S-P試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，一抗Galectin-3羊多抗（1:50），每批染色均設(shè)立陰性空白對(duì)照（以PBS液代替一抗）。

1.3.2 RT-PCR法 TaKaRa RNA PCR試劑盒購(gòu)自大連寶生物公司；RNA提取試劑Trizol購(gòu)自Invitrogen公司。DL2000 DNA Marker購(gòu)自大連寶生物公司。RNA一步法提取總RNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)量樣品濃度和純度，所得RNA260/280值在1.8-2.0，電泳18S和28S RNA條帶清晰。按Oligotex mRNA Midi Kit（MagExtractor公司）說(shuō)明分離純化為mRNA。各引物均由大連寶生物合成，擴(kuò)增條件：94oC、2 min，94oC、30 s，56oC、30 s，72oC、30 s。30個(gè)循環(huán)。RT-PCR所用的引物序列如下：Galectin-3上游：5'-ATGGCAGACAATTTTTCGCTCC-3'；下游：5'-ATGTCACCAGAAATTCCCAGTT-3'；β-actin上游：5'-TGACGGGGTCACCCACACTGTGCCCATCTA-3'；下游：5'-CTAGAAGCATTTGCGGTGGACGATGGAGGG-3'。

1.4 免疫組化結(jié)果 分別由兩名經(jīng)驗(yàn)豐富的病理醫(yī)師在不知臨床和病理資料的情況下獨(dú)立觀察切片，對(duì)免疫組化結(jié)果進(jìn)行評(píng)估。Galectin-3主要表達(dá)于胞質(zhì)和胞核中，陽(yáng)性表達(dá)為黃色或黃棕色顆粒。按染色強(qiáng)度及染色細(xì)胞數(shù)量劃分等級(jí)，陰性（-）：顯色強(qiáng)度與背景無(wú)明顯差別；弱陽(yáng)性（+）：顯色強(qiáng)度為淡黃色或僅個(gè)別細(xì)胞呈黃至棕黃色染色，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)＜10%；中度陽(yáng)性（++）：顯色強(qiáng)度呈黃至棕黃色染色，陽(yáng)性細(xì)胞10%-60%；強(qiáng)陽(yáng)性（+++）：顯色強(qiáng)度呈棕褐色，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)＞60%。

1.5 隨訪 采用電話回訪和病案查詢的方式進(jìn)行隨訪，記錄總生存期（overall survival, OS）。OS定義為從術(shù)后第一天至死亡或隨訪截止時(shí)間。隨訪截止于2012年12月31日。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0軟件，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行χ2檢驗(yàn)，非參數(shù)秩和檢驗(yàn)及Spearman等級(jí)相關(guān)檢驗(yàn)，P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 Galectin-3在NSCLC組織中的表達(dá) Galectin-3在正常肺組織陽(yáng)性表達(dá)率為11.76%（2/17），在NSCLC組織中陽(yáng)性表達(dá)率為83.8%（52/62），二者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=30.069, P＜0.001），即NSCLC組織中Galectin-3的陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于正常肺組織（圖1）。

2.2 Galectin-3的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系 Galectin-3在NSCLC組織中的表達(dá)與患者的性別（χ2=0.113, P＞0.05）和年齡（χ2=0.220, P＞0.05）差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表1）。Galectin-3在肺鱗癌中陽(yáng)性率為86.2%（27/32），肺腺癌中陽(yáng)性率為80.8%（25/30），二者之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（χ2=0.012, P＞0.05）（圖2）；Galectin-3與腫瘤的分化程度（χ2=8.577, P＜0.05）和臨床分期（χ2=5.287, P＜0.05）相關(guān)，其中與分化程度（r=-0.292, P＜0.05）的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，與臨床分期（r=0.336, P＜0.05）的表達(dá)呈正相關(guān)。

2.3 RT-PCR中Galectin-3的表達(dá)水平 RT-PCR 結(jié)果表明在10例新鮮NSCLC組織中無(wú)論是鱗癌組織還是腺癌組織Galectin-3均為高表達(dá)，其陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于正常肺組織（圖3）。這與免疫組化的結(jié)果是一致的，進(jìn)一步證實(shí)了免疫組化的結(jié)果。

圖 1 Galectin-3在正常肺組織的陰性表達(dá)（S-P法，×200）Fig 1 The negative expression of Galectin-3 in lung tissue（S-P method, ×200）

圖 3 RT-PCR結(jié)果：Galectin-3在非小細(xì)胞肺癌組織中表達(dá)明顯高于正常肺組織Fig 3 Results of RT-PCR: Expression of Clusterin in lung cancer tissues was significantly higher than in normal lung tissues

圖 2 Galectin-3在肺腺癌和肺鱗癌中呈陽(yáng)性表達(dá)（S-P法，A，B：×100；C，D：×400）Fig 2 The expression of Galectin-3 in lung adenocarcinoma and squamous cell carcinoma (S-P method, A, B: ×100; C, D: ×400)

2.4 Galectin-3的表達(dá)與患者生存率的關(guān)系 Galectin-3陽(yáng)性表達(dá)的肺癌患者中位生存期為34.56個(gè)月，Galectin-3陰性表達(dá)的肺癌患者中位生存期＞80個(gè)月，存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.045）（圖4）。

3 討論

Galectins是凝集素家族中的一員，能與β-半乳糖苷特異性結(jié)合。自1975年報(bào)道第一個(gè)哺乳動(dòng)物Galectin以來(lái)，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)15個(gè)成員[2]。其中對(duì)Galectin-3的研究最為廣泛，它首先發(fā)現(xiàn)于巨噬細(xì)胞中，現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)一些其它組織中也存在，如：腸、腦、腎、骨、肺、前列腺[3-5]及許多癌組織中。

圖 4 Galectin-3與總生存期的關(guān)系Fig 4 The realationship between Galectin-3 and overall survival

Galectin-3是半乳糖凝集素家族的重要成員之一，與細(xì)胞內(nèi)的糖蛋白、細(xì)胞表面分子和細(xì)胞外基質(zhì)作用，參與細(xì)胞粘附、增殖、凋亡、血管形成及mRNA剪切[1,6-7]等，與許多腫瘤的細(xì)胞增殖及侵襲、轉(zhuǎn)移等惡性生物學(xué)行為密切相關(guān)。目前，在許多惡性腫瘤中都發(fā)現(xiàn)了Galectin-3的表達(dá)，如乳腺癌、前列腺癌、甲狀腺癌、肝癌、星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤等[8-11]。Galectin-3不僅與腫瘤的發(fā)生有關(guān)，與腫瘤的轉(zhuǎn)移也有關(guān)聯(lián)[11]。已報(bào)道Galectin-3在多種腫瘤中過(guò)表達(dá)并參與腫瘤轉(zhuǎn)移的調(diào)控，包括胃癌、腦腫瘤、結(jié)腸癌和甲狀腺癌[12,13]。

肺癌是當(dāng)今世界上嚴(yán)重威脅人類(lèi)生命健康的惡性腫瘤之一，發(fā)病率在許多國(guó)家都有增高趨勢(shì)，根據(jù)WHO的數(shù)據(jù)，肺癌目前是全世界癌癥死因的第一名，約占全部惡性腫瘤的19%。全世界每年的新增病例超過(guò)120萬(wàn)。在男性腫瘤死因中已居首位，在女性中僅次于乳腺癌居第二位。因此，早期診斷和治療極為重要。Mathieu等于2003年首次報(bào)道了Galectin-3基因在肺癌中的表達(dá)情況，其中NSCLC組中Galectin-3基因過(guò)表達(dá)，表達(dá)量是正常上皮細(xì)胞的3倍；相反，小細(xì)胞肺癌（small cell lung cancer, SCLC）者均不表達(dá)或低表達(dá)。此研究[14]還證實(shí)過(guò)表達(dá)的Galectin-3表達(dá)水平上調(diào)可能促進(jìn)了NSCLC的轉(zhuǎn)移，但與SCLC轉(zhuǎn)移無(wú)關(guān)。Buttery等用免疫組化法對(duì)不同類(lèi)型肺癌組織中Galectin-3的表達(dá)進(jìn)行評(píng)估。證實(shí)在NSCLC中，Galectin-3呈高表達(dá)；而在SCLC中，Galectin-3表達(dá)水平及低。在NSCLC中，鱗癌與腺癌中Galectin-3的表達(dá)沒(méi)有明顯區(qū)別，且均表達(dá)在胞漿和胞核中[15]。在鱗癌細(xì)胞中，Galectin-3在不同分化程度的細(xì)胞中表達(dá)水平不同，腫瘤分化程度越低其表達(dá)水平越高，但差別沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在腺癌細(xì)胞中，Galectin-3在不同分化程度的細(xì)胞中表達(dá)水平未見(jiàn)明顯不同[15]。

為了進(jìn)一步觀察Galectin-3在NSCLC中的表達(dá)與臨床病理特征間的關(guān)系，為臨床診斷和預(yù)后尋找新的靶點(diǎn)，我們選取了62例NSCLC組織和17例正常肺組織進(jìn)行了免疫組化方法檢測(cè)。結(jié)果顯示：NSCLC組織中Galectin-3的表達(dá)明顯高于正常肺組織，提示Galectin-3在NSCLC的發(fā)生發(fā)展中可能起一定的意義，與Buttery等的研究結(jié)果一致。另外我們發(fā)現(xiàn)NSCLC中不同的TNM分期、不同的病理分級(jí)與Galectin-3的表達(dá)具有相關(guān)性，癌組織的分化越差、分期越晚Galectin-3表達(dá)越高（P＜0.05），RT-PCR的結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)Galectin-3在肺癌組織中的表達(dá)明顯高于正常肺組織，說(shuō)明其表達(dá)高低與腫瘤的惡性生物學(xué)行為有關(guān)。隨訪結(jié)果亦顯示Galectin-3與患者的總生存率相關(guān)，Galectin-3陽(yáng)性表達(dá)的患者預(yù)后較差（P=0.045）。由此可見(jiàn)，Galectin-3可能是評(píng)價(jià)NSCLC預(yù)后的又一個(gè)重要基因，可能作為判斷NSCLC惡性程度及不良預(yù)后的生物學(xué)指標(biāo)之一。

生物學(xué)標(biāo)志物的不斷發(fā)現(xiàn)，為NSCLC的診斷和治療提供了重要線索。Galectin-3有望成為今后治療NSCLC的一個(gè)新靶點(diǎn)，與肺癌其它標(biāo)志物聯(lián)合檢查以提高診斷率。總之，我們通過(guò)免疫組化方法檢測(cè)NSCLC組織及正常肺組織中Galectin-3蛋白的表達(dá)情況，分析發(fā)現(xiàn)Galectin-3蛋白的表達(dá)與患者的臨床特征及預(yù)后密切相關(guān)，對(duì)判斷NSCLC患者的預(yù)后具有重要意義。