人肺癌A549細(xì)胞系腫瘤干細(xì)胞的篩選和鑒定

夏暉 于長(zhǎng)海 張文 張寶石 趙英男 方芳

非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）約占肺癌總數(shù)的80%-85%，對(duì)放療和化療易產(chǎn)生抵抗性，患者5年的生存率低，生存質(zhì)量差[1,2]。深入研究肺癌發(fā)生，發(fā)展的分子機(jī)制，探尋新的治療靶點(diǎn)，提高NSCLC的臨床治療效果是人們關(guān)注的問題。腫瘤干細(xì)胞（cancer stem cells,CSCs）是處于各種不同分化程度的一小群干細(xì)胞樣細(xì)胞，具有自我更新和無限增殖能力以及多向分化潛能，是腫瘤形成的起始細(xì)胞并維持腫瘤的持續(xù)生長(zhǎng)，在腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)及耐藥中起關(guān)鍵作用。目前研究[3,4]認(rèn)為，腫瘤干細(xì)胞對(duì)常規(guī)治療有抵抗性，且具有再次形成腫瘤的能力，因而其可能是腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的根源。研究[5,6]表明，CD133陽性細(xì)胞具有高度增殖分化潛能和體內(nèi)成瘤能力及干細(xì)胞樣特性；ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族中ABCG2（ATP-binding cassette superfamily G member 2, ABCG2）與干細(xì)胞泵出Hoechst染料的特性有關(guān)，經(jīng)此方法分離得到的SP細(xì)胞經(jīng)鑒定就可確認(rèn)為干細(xì)胞，ABCG2已被認(rèn)為是一種篩選干細(xì)胞的表面標(biāo)志物分子；為了研究腫瘤干細(xì)胞的生物學(xué)特性，如何分離出腫瘤干細(xì)胞是關(guān)鍵的一步。肺癌干細(xì)胞被視為是肺癌惡性表型的根源和潛在的治療靶點(diǎn)。本研究選用NSCLC細(xì)胞系A(chǔ)549為研究對(duì)象，通過免疫熒光激活的流式細(xì)胞術(shù)篩選A549細(xì)胞系中SP（side population）細(xì)胞亞群，并觀察CD133和ABCG2的表達(dá)，為探索NSCLC治療的新途徑提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器和試劑 人肺癌A549細(xì)胞株購于軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院。二甲基亞砜（Dimethyl sulfoxide, DMSO）、Hoechesl33342、維拉帕米（Verapamil）購于Sigma公司；胎牛血清購于Hyclone公司；DMEM（Dulbecco's modified eagle medium）培養(yǎng)基購于Gibco公司。細(xì)胞培養(yǎng)箱為日本Tabai Espec Co.生產(chǎn)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 人肺癌A549細(xì)胞，常規(guī)培養(yǎng)于含10%滅活胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，置37oC、5%CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞制備成 1×106/L單細(xì)胞懸液，加入Hoechst33342染料（5 μg/mL），37oC避光條件下，孵育90 min。對(duì)照組細(xì)胞中，同時(shí)加入維拉帕米（100 mM），按上述過程處理細(xì)胞。各組細(xì)胞經(jīng)FACS緩沖液處理后，在355 nm激發(fā)光波長(zhǎng)處，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞設(shè)定參數(shù)的變化，測(cè)量前向散射和側(cè)向散射參數(shù)，以Hoechst red為X軸，Hoechst blue為Y軸作二維散點(diǎn)圖，將維拉帕米組缺失的區(qū)域設(shè)為SP細(xì)胞范圍，分選出SP干細(xì)胞亞群和非SP干細(xì)胞亞群，并計(jì)算百分比。將分選出的SP細(xì)胞和非SP細(xì)胞分別接種于10%的軟瓊脂，觀察兩組細(xì)胞克隆形成能力的差別。MTT法觀察所篩選的兩組細(xì)胞增殖能力的區(qū)別，并繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

1.3 RT-PCR分析 經(jīng)流式細(xì)胞儀分選的SP細(xì)胞和非SP細(xì)胞，以1×106/瓶接種A549細(xì)胞于T25培養(yǎng)瓶，置5%CO2孵箱。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期的細(xì)胞，Trizol法提取細(xì)胞總RNA，RT-PCR分析干細(xì)胞標(biāo)志物分子CD133和ABCG2 mRNA表達(dá)的變化，產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離，0.5%溴化乙錠染色后，凝膠成像儀觀察圖像并計(jì)算灰度值，分析各組間差異。

1.4 Western blot分析 經(jīng)流式細(xì)胞儀分選的SP細(xì)胞和非SP細(xì)胞，以1×106/瓶接種A549細(xì)胞于T25培養(yǎng)瓶，置5%CO2孵箱。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期的細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液，15,000 rpm、10 min，取上清，Bradford法蛋白定量，經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳后將蛋白轉(zhuǎn)到硝酸纖維素膜上，5%脫脂奶粉封閉，再分別加入CD133和ABCG2分子的一抗（1:1,000）和辣根酶標(biāo)記的二抗（1:500），室溫下振蕩孵育1 h，ECL發(fā)光試劑盒發(fā)光顯影，Bio-Rad圖像分析軟件進(jìn)行圖像掃描和分析。同時(shí)用內(nèi)參蛋白Actin對(duì)目的分子進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。

1.5 致瘤能力實(shí)驗(yàn) 經(jīng)流式細(xì)胞儀分選的上述SP細(xì)胞和非SP細(xì)胞，以1×104的密度接種至裸鼠皮下，2周后觀察兩組細(xì)胞致瘤能力的差別。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析，P＜0.05表示差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 A549細(xì)胞中SP干細(xì)胞亞群的分選 如圖1所示，肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549細(xì)胞中SP細(xì)胞分布情況。圖1A顯示SP細(xì)胞所占比例為5.93%。圖1B為加入維拉帕米的對(duì)照組，SP細(xì)胞基本消失為0.32%。圖1C顯示SP細(xì)胞可以形成明顯的腫瘤細(xì)胞克隆。圖1D顯示非SP細(xì)胞不能形成明顯的細(xì)胞克隆。

2.2 細(xì)胞增殖結(jié)果 圖2所示，經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)篩選的SP細(xì)胞和非SP細(xì)胞在無血清培養(yǎng)條件下，分別繪制生長(zhǎng)曲線，兩組細(xì)胞增殖能力差別明顯，SP細(xì)胞具有明顯的增殖效應(yīng)（P＜0.001, n=6）。

2.3 RT-PCR結(jié)果 圖3結(jié)果顯示，SP干細(xì)胞亞群中CD133和ABCG2 mRNA明顯高于非SP干細(xì)胞亞群（P＜0.05, n=5）。

2.4 Western blot結(jié)果 圖4結(jié)果顯示，SP干細(xì)胞亞群中CD133和ABCG2 mRNA明顯高于非SP干細(xì)胞亞群（P＜0.05,n=5），各組A549細(xì)胞的內(nèi)參蛋白Actin表達(dá)水平一致。

2.5 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果 圖5結(jié)果顯示，接種SP亞群細(xì)胞的動(dòng)物，2周后可以形成明顯的種植瘤，而對(duì)照組非SP亞群細(xì)胞種植的動(dòng)物未見有明顯的腫瘤形成（P＜0.001, n=7）。

3 討論

CSCs也稱為“腫瘤起始細(xì)胞”（tumor initiating cells,TICs），具有自我更新和無限增殖能力以及多向分化潛能。研究[7,8]發(fā)現(xiàn)，在血液系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤、乳腺癌等腫瘤中，干細(xì)胞樣細(xì)胞決定了腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程。腫瘤干細(xì)胞學(xué)說和理論不僅為腫瘤發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移機(jī)制的研究帶來新的思路，同時(shí)為腫瘤臨床診斷和治療帶來新希望，是腫瘤學(xué)領(lǐng)域具有劃時(shí)代意義的全新理論。本研究中，肺癌干細(xì)胞的篩選主要是利用干細(xì)胞中轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白可以主動(dòng)外泵熒光染料（Hoechst染料）的特點(diǎn)，結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)，經(jīng)過雙波長(zhǎng)分析，激發(fā)不同顏色的弱紅光和藍(lán)光，此群呈鳥嘴狀分布的細(xì)胞主要集中于低熒光信號(hào)區(qū)域，僅占總體肺癌細(xì)胞的極少數(shù)，即為肺癌的邊緣群細(xì)胞（SP細(xì)胞），而不具有外排功能的、高熒光信號(hào)的細(xì)胞即為占細(xì)胞整體絕大多數(shù)的非SP細(xì)胞。

圖 1 流式細(xì)胞術(shù)篩選SP干細(xì)胞亞群Fig 1 Isolated slide population (SP) cancer stem cells using FACS

圖 2 SP細(xì)胞和非SP細(xì)胞增殖能力比較Fig 2 The ability of cell proliferation between SP and non-SP cells

圖 3 CD133和ABCG2 mRNA表達(dá)水平。A、C：CD133 mRNA表達(dá)；B、D：ABCG2 mRNA表達(dá)。Fig 3 The expression level of CD133 and ABCG2 mRNA. A, C: CD133 mRNA expression; B, D: ABCG2 mRNA expression.

圖 4 CD133和ABCG2蛋白表達(dá)水平。A、C：CD133蛋白表達(dá)；B、D：ABCG2蛋白表達(dá)。Fig 4 The expression level of CD133 and ABCG2 protein. A, C: CD133 protein expression; B, D:ABCG2 protein expression.

圖 5 體外致瘤能力實(shí)驗(yàn)Fig 5 The tumorigenicity experiment in vitro

我們的研究結(jié)果表明，經(jīng)過流式細(xì)胞儀成功分選了人肺腺癌A549細(xì)胞系SP細(xì)胞亞群，結(jié)果表明此SP細(xì)胞亞群約占A549細(xì)胞總數(shù)的5.93%，經(jīng)維拉帕米處理后Hoechest33342陰性/弱陽性細(xì)胞含量下降為0.32%，結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道，維拉帕米可以阻斷SP細(xì)胞排出Hoechest33342，提示此亞群細(xì)胞體現(xiàn)Hoechest33342陰性/弱陽性的特性，為篩選所分離的SP細(xì)胞，其克隆形成能力明顯高于非SP細(xì)胞。同時(shí)，MTT結(jié)果提示，經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)篩選的SP細(xì)胞和非SP細(xì)胞在無血清培養(yǎng)條件下，兩組細(xì)胞增殖能力差別明顯，SP細(xì)胞具有明顯的增殖效應(yīng)。體外致瘤能力實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，接種SP亞群細(xì)胞的動(dòng)物，2周后可以形成明顯的種植瘤，而對(duì)照組非SP亞群細(xì)胞種植的動(dòng)物未見有明顯的腫瘤形成。

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，CD133為人造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞的標(biāo)志物分子，同時(shí)在多種腫瘤組織中還發(fā)現(xiàn)CD133分子的高表達(dá)可以作為肝癌、前列腺癌、胰腺癌、結(jié)腸癌等腫瘤干細(xì)胞的陽性標(biāo)記物分子。研究[9,10]發(fā)現(xiàn)，CD133陽性細(xì)胞具有自我更新、不斷分化并促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)的特性，與患者的淋巴轉(zhuǎn)移和預(yù)后相關(guān)。我們的試驗(yàn)結(jié)果也表明，經(jīng)過流式細(xì)胞儀篩選的肺癌SP細(xì)胞群，明顯地高表達(dá)干細(xì)胞標(biāo)志物分子CD133，提示經(jīng)過篩選分離的肺癌SP細(xì)胞群具有干細(xì)胞樣特性。ABCG2分子屬于ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族，編碼由655個(gè)氨基酸組成的跨膜蛋白，在白血病細(xì)胞或乳腺癌等腫瘤干細(xì)胞表面均有表達(dá)。研究[11,12]發(fā)現(xiàn)，白血病細(xì)胞或乳腺癌細(xì)胞的耐藥性與ABCG2蛋白密切相關(guān)，下調(diào)ABCG2分子的表達(dá)可以降低腫瘤細(xì)胞耐藥現(xiàn)象的發(fā)生，提示ABCG2作為腫瘤干細(xì)胞表面的標(biāo)志物分子，可能與腫瘤干細(xì)胞參與耐藥的過程相關(guān)。我們的試驗(yàn)結(jié)果表明，經(jīng)過流式細(xì)胞儀篩選的肺癌SP細(xì)胞群明顯地高表達(dá)干細(xì)胞標(biāo)志物分子ABCG2。

我們的研究證明：流式細(xì)胞術(shù)篩選的SP細(xì)胞，經(jīng)mRNA和蛋白水平分析，均高表達(dá)CD133和ABCG2；我們所篩選的SP細(xì)胞可以形成明顯的腫瘤細(xì)胞克隆，而非SP細(xì)胞不能形成明顯的細(xì)胞克隆，SP細(xì)胞細(xì)胞增殖能力和體外致瘤能力均明顯高于非SP細(xì)胞，上述結(jié)果明確提示我們所篩選的細(xì)胞為肺癌干細(xì)胞。綜上所述，本研究中經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)分離篩選的肺癌SP細(xì)胞群，表達(dá)特異性的干細(xì)胞標(biāo)志物分子CD133和ABCG2，可以用于進(jìn)一步的肺癌干細(xì)胞的研究中，為肺癌干細(xì)胞參與肺癌的發(fā)生，發(fā)展及耐藥等機(jī)制的深入研究提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論基礎(chǔ)，具有一定的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值和意義，但具體相關(guān)機(jī)制還有待進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)來證實(shí)。