檢測(cè)肺癌患者血清Cathepsin X及Cystatin C的臨床意義

張學(xué)德 侯彥麗 牛澤群 李維 孟夏 張娜 楊拴盈

組織蛋白酶（Cathepsins, Cats）屬于溶酶體半胱氨酸蛋白酶，最初發(fā)現(xiàn)涉及到溶酶體內(nèi)蛋白轉(zhuǎn)換，近年來(lái)研究[1,2]表明，還參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移，有希望成為新的腫瘤診斷和預(yù)后判斷標(biāo)記物。Cat B、Cat L等在肺癌、乳腺癌、頭頸癌及結(jié)腸癌等腫瘤中表達(dá)明顯增高，且高表達(dá)的患者預(yù)后更差，對(duì)預(yù)測(cè)腫瘤的復(fù)發(fā)和預(yù)后有潛在價(jià)值[3]。Cat X是最近發(fā)現(xiàn)的一種Cats家族成員，它的結(jié)構(gòu)和功能特點(diǎn)明顯不同于其它Cats，有一個(gè)區(qū)別于其它Cats的非常短的原區(qū)（pro-region）和一個(gè)獨(dú)特的迷你環(huán)（mini-loop），Cat X不像其它Cats作為肽鏈內(nèi)切酶發(fā)揮生物學(xué)作用，而靠水解羧基端氨基酸起作用。Cat X表達(dá)主要局限于各類免疫細(xì)胞中，如單核、巨噬細(xì)胞及樹突狀細(xì)胞[4]。它涉及到細(xì)胞間信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞粘附、增生以及遷移等作用[5-7]。研究表明Cat X表達(dá)上調(diào)與幽門螺旋桿菌感染[8]、多發(fā)創(chuàng)傷[9]、肺結(jié)核[10]有關(guān)，也有報(bào)道發(fā)現(xiàn)Cat X在前列腺癌[11]、胃癌[8]、惡性黑色素瘤[12]中表達(dá)明顯增高。此外，已經(jīng)在多種腫瘤中發(fā)現(xiàn)染色體20q13中編碼Cat X基因明顯擴(kuò)增[13,14]。

Cystatin C是半胱氨酸蛋白酶抑制劑蛋白質(zhì)中的一種，在所有的有核細(xì)胞內(nèi)以恒定速度持續(xù)轉(zhuǎn)錄與表達(dá)，無(wú)組織特異性，并存在于各種體液之中，不受年齡、性別、體重、炎癥等因素影響，是一種反映腎小球?yàn)V過(guò)情況的重要指標(biāo)。目前研究[15]表明，它作為Cats抑制劑與Cats互相作用參與腫瘤發(fā)生、發(fā)展。近期研究發(fā)現(xiàn)血液、體液中cystatin C高表達(dá)的患者預(yù)后差，有希望作為預(yù)測(cè)腫瘤預(yù)后標(biāo)記物。

目前為止，我們尚未發(fā)現(xiàn)肺癌患者血清Cat X的研究，cystatin C在肺癌患者血清研究的報(bào)道也少見，cystatin C作為Cats強(qiáng)有力的抑制劑，它與Cat X血清表達(dá)水平之間可能存在相關(guān)性。目前已有cystatin C與Cat B、Cat L的相關(guān)性研究，但是尚無(wú)cystatin C與Cat X之間的研究。本研究旨在檢測(cè)肺癌患者和健康人血清Cat X與cystatin C表達(dá)水平以及二者相關(guān)性和與肺癌臨床病理、預(yù)后關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 選擇2007年3月-9月西安交大二附院84例肺癌患者，其中男性50例，女性34例，年齡41歲-78歲，中位年齡61.5歲；鱗癌30例，腺癌40例，小細(xì)胞肺癌（small cell lung cancer, SCLC）14例。臨床分期（TNM分期），I期+II期28例，III期+IV期56例。所有患者均經(jīng)過(guò)組織學(xué)或病理學(xué)檢查確診為肺癌，采血前均未行手術(shù)、放化療以及中成藥等其它抗腫瘤治療。另外，選取健康查體者36例作為對(duì)照組，男性20例，女性16例；年齡40歲-79歲，中位年齡60.4歲。本研究得到西安交大二附院倫理委員會(huì)許可，患者均簽署知情同意書。

1.2 標(biāo)本采集 所有肺癌患者和健康體檢者分別抽取晨間空腹靜脈血3 mL，抽取后1 h內(nèi)，4oC，3,000 g離心10 min，分離的血清-80oC凍存待檢。

1.3 檢測(cè)方法 Cat X及cystatin C水平均采用酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定。嚴(yán)格按照ELISA檢測(cè)試劑盒（上海郎卡公司）的說(shuō)明書操作，標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50 μL；然后樣本孔先加待測(cè)樣本10 μL，再加樣本稀釋液40 μL；后分別加入辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的檢測(cè)抗體100 μL，封板膜封孔，37oC恒溫箱溫育60 min。手工洗板法清洗，每孔加入底物A、B各50 μL，37oC避光孵育15 min，后每孔加入終止液50 μL，15 min內(nèi)，在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的OD值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 隨訪 84例患者術(shù)后均進(jìn)行了隨訪，總生存期OS定義為首次確診至患者死亡時(shí)間或末次隨訪時(shí)間。死于非肺癌相關(guān)原因的患者排除在本研究外。隨訪最長(zhǎng)時(shí)間為60個(gè)月。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。每組數(shù)據(jù)均采用Mean±SD表示。組間差異采取Mann-Whitney和Kruskal-Wallis檢驗(yàn)。Pearson's相關(guān)系數(shù)評(píng)價(jià)Cat X和cystatin C之間的相關(guān)性。Kaplan-Meier法（組間生存率比較采用Log-rank檢驗(yàn)）及Cox單因素以及多因素風(fēng)險(xiǎn)回歸模型進(jìn)行生存分析。雙側(cè)P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肺癌患者和健康人Cat X和cystatin C表達(dá)水平比較肺癌患者及健康人血清Cat X水平分別為（2.24±0.07）ng/mL、（1.85±0.09）ng/mL；cystatin C分別為（529.77±6.15）ng/mL、（476.76±13.95）ng/mL。肺癌患者血清Cat X和cystatin C水平明顯高于健康人（P＜0.01）。此外，肺癌患者cystatin C/Cat X比值與健康人相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.372）。Pearson相關(guān)分析顯示，肺癌患者血清Cat X與cystatin C水平無(wú)明顯相關(guān)性（r=-0.049,P=0.66）。

2.2 肺癌患者Cat X和cystatin C表達(dá)水平與臨床病理特征的關(guān)系 Cat X和cystatin C/Cat X與肺癌患者性別、年齡、病理類型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、細(xì)胞分化及TNM分期無(wú)明顯相關(guān)，但Cat X與病理類型有相關(guān)趨勢(shì)（P=0.076），cystatin C/Cat X與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有相關(guān)趨勢(shì)（P=0.058）。cystatin C水平與肺癌分期相關(guān)，III期+IV期肺癌患者cystatin C水平明顯高于I期+II期（P=0.01），與其它臨床病理特征無(wú)關(guān)（表1）。

2.3 肺癌患者Cat X和cystatin C水平與預(yù)后的關(guān)系

2.3.1 Kaplan-Meier生存分析 將患者性別、淋巴結(jié)狀態(tài)、分化程度、分期分組，以及根據(jù)年齡、Cat X、cystatinC、cystatin C/Cat X的中位數(shù)以二分法的方式分＜中位數(shù)組以及≥中位數(shù)組，進(jìn)行Kaplan-Meier生存分析，生存差異的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義用Log-rank法判定。結(jié)果示低Cat X和高Cat X患者中位OS分別為22.9個(gè)月和15.8個(gè)月，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.019, RR=1.678），低Cat X患者和高Cat X患者相比OS更長(zhǎng)（圖1）。I期+II期和III期+IV期肺癌患者中位OS分別為23.8個(gè)月和15.4個(gè)月，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.011, RR=1.827），晚期肺癌患者預(yù)后更差（圖2）。高、低cystatin C/Cat X值患者中位OS分別為23.5個(gè)月和18.5個(gè)月，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但有一定的差異趨勢(shì)（P=0.069）。性別、年齡、淋巴結(jié)狀態(tài)、分化程度以及cystatin C對(duì)肺癌患者OS無(wú)明顯影響（表2）。

表 1 肺癌患者血清Cat X和cystatin C表達(dá)水平與臨床病理特征的關(guān)系Tab 1 Relationship of Cat X and cystatin C in the sera of patients with lung cancer on the clinicopathological parameters

圖 1 血清Cat X高表達(dá)組和低表達(dá)組肺癌患者Kaplan-Meier生存曲線Fig 1 Kaplan-Meier survival curves of lung cancer patients with low or high levels of Cat X in sera

圖 2 TNM I+II組和III+IV組肺癌患者生存曲線Fig 2 Kaplan-Meier survival curves of lung cancer patients with TNM stage I+II or stage III+IV

2.3.2 Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型分析 采取單因素及多因素Cox回歸法分析影響肺癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。利用Cox單因素回歸分析發(fā)現(xiàn)Cat X高表達(dá)以及TNM分期是影響肺癌預(yù)后獨(dú)立因素，繼續(xù)將各個(gè)變量引入Cox多因素回歸模型，結(jié)果顯示，僅有TNM分期是患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（表2）。

表 2 單因素和多因素分析肺癌Cat X、cystatin C及其它因素與預(yù)后的情況Tab 2 Univariate and multivariate analysis of Cat X, cystatin C, and other potential factors for prognosis in patients with lung cancer

3 討論

肺癌是目前發(fā)病率高的惡性腫瘤之一，大部分發(fā)現(xiàn)時(shí)已經(jīng)是中晚期，失去了手術(shù)機(jī)會(huì)，患者生存期短，5年生存率約15%[16]。因此肺癌的早診斷、早治療至關(guān)重要。血清腫瘤標(biāo)記物具有取材方便、方法易行等獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，在肺癌早期診斷、預(yù)后判斷中有重要價(jià)值，因此人們一直在尋找有價(jià)值的血清腫瘤標(biāo)記物。

Cat X是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)一種新的Cats，通常以酶原形式存在于免疫細(xì)胞的溶酶體內(nèi)，受到激活后，轉(zhuǎn)化為有活性的酶釋放到血液和細(xì)胞外基質(zhì)中[17]。Cat X在惡性腫瘤患者血清和細(xì)胞外基質(zhì)中也有表達(dá)，Vizin等[18]研究了Cat X在結(jié)腸癌、腺瘤、其它結(jié)腸良性病變以及健康者血清中的表達(dá)情況，雖未發(fā)現(xiàn)Cat X在4組中表達(dá)有差異，但Cat X水平高的結(jié)腸癌患者OS更短。Decock等[19]比較了早期乳癌和炎性乳癌中血清Cat X水平，發(fā)現(xiàn)炎性乳癌患者中血清Cat X中水平低，有可能為炎性乳癌的診斷提供一定的參考價(jià)值。本研究檢測(cè)了肺癌患者和健康人血清Cat X水平，結(jié)果提示肺癌患者Cat X水平明顯高于健康人，提示Cat X可能與肺癌發(fā)生有關(guān)，有希望作為肺癌的腫瘤標(biāo)記物。

Cystatin C是Cats抑制劑，可能會(huì)減輕Cats在腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移過(guò)程中作用[20]。Nishikawa等[21]用ELISA法檢測(cè)良、惡性卵巢瘤患者和健康人的血清cystatin C，發(fā)現(xiàn)卵巢癌患者血清cystatin C水平明顯高于良性腫瘤及健康人。Saleh等[22]也發(fā)現(xiàn)在結(jié)直腸癌組織中cystatin C高表達(dá)，特別是在腺癌中達(dá)到100%。然而也有研究[23]表明在肺鱗癌和正常肺組織中表達(dá)無(wú)明顯差異。Wegiel等[24]則發(fā)現(xiàn)前列腺癌中cystatin C表達(dá)減低。我們檢測(cè)了肺癌患者和健康人血清cystatin C水平，結(jié)果示肺癌患者血清cystatin C水平明顯高于健康人。究其原因可能是肺癌患者中Cats升高，cystatin C為了抑制其活性也隨之升高，但是仍然無(wú)法有效抑制蛋白水解酶的活性，導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。

Cystatin C與Cats之間的失衡可能與腫瘤發(fā)生有關(guān)。Zore等[25]發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌患者血清Cat B的含量增加，cystatin C也隨之增加，但Cat B的活性并未被相應(yīng)增加的cystatin C抑制，提示隨著腫瘤的進(jìn)展，兩者改變的同時(shí)伴隨Cat B和cystatin C之間的失平衡。故有人把cystatin C與Cats的比值作為診斷腫瘤惡性程度的指標(biāo)。本研究提示肺癌患者cystatin C/Cat X比值與健康人相比，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，未見到cystatin C和Cat X失衡與肺癌相關(guān)。我們研究發(fā)現(xiàn)肺癌患者血清cystatin C和Cat X之間無(wú)相關(guān)性。Chen等[26]報(bào)道cystatin C與Cat B、Cat L之間無(wú)明顯相關(guān)。原因可能是由于cystatin C并不是Cats唯一的抑制劑，其它抑制劑如stefin A也可能涉及到Cats的抑制。

本研究顯示，Cat X與肺癌患者性別、年齡、病理類型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、細(xì)胞分化及TNM分期之間無(wú)明顯相關(guān)。Sevenich等[27]研究提示，在基因敲除的乳腺癌小鼠模型中，Cat X在腫瘤發(fā)展的初期表達(dá)增高，而在進(jìn)展期及轉(zhuǎn)移瘤中表達(dá)降低。此外Hidaka等[13]研究結(jié)果提示20q13.2擴(kuò)增與結(jié)腸癌進(jìn)展和轉(zhuǎn)移有關(guān)。Wang等[28]研究也發(fā)現(xiàn)Cat X與晚期肝癌有關(guān)。而Lines等[29]報(bào)道了相反的結(jié)論，提示Cat X降低了細(xì)胞粘附，并減少胰腺癌轉(zhuǎn)移。這些不同研究結(jié)果可能由于樣本量偏小、檢測(cè)方法以及檢測(cè)標(biāo)本不同或Cat X在不同腫瘤中表達(dá)不同所致。

本研究顯示，cystatin C與肺癌分期有關(guān)，但是與其它臨床特征之間無(wú)明顯相關(guān)。Vigneswaran等[30]研究發(fā)現(xiàn)cystatin C與乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無(wú)關(guān)，但與腫瘤大小有關(guān)。Saleh等[22]研究發(fā)現(xiàn)cystatin C在晚期結(jié)腸癌中表達(dá)高于早期結(jié)腸癌。本研究與上述研究一致，提示cystatin C升高可能與腫瘤浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移有關(guān)。

本研究未發(fā)現(xiàn)cystatin C/Cat X比值與肺癌臨床病理特征相關(guān)。Kolwijck等[31]報(bào)道cystatin C/Cat H和cystatin C/Cat X比值與卵巢癌病理類型相關(guān)，在低分化癌中明顯升高。cystatin C與Cat X失衡與腫瘤研究甚少，還需要進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量或在其它腫瘤上進(jìn)一步研究。

本研究表明，Cat X低水平肺癌患者同高水平患者相比有更好的OS。Vizin等[18]報(bào)道了血清Cat X高水平的結(jié)腸癌患者OS更短，與結(jié)腸癌預(yù)后有關(guān)。本研究與Vizin等[18]研究一致，提示Cat X有希望作為判斷肺癌預(yù)后的指標(biāo)。

我們研究提示，血清cystatin C高水平的肺癌患者OS短于低水平者（22.6個(gè)月 vs 13.7個(gè)月），但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.105）。Strojan等[32]研究報(bào)道cystatin C與頭頸部腫瘤預(yù)后有關(guān)，cystatin C低表達(dá)的患者無(wú)病生存期更長(zhǎng)。Kos等[33]研究了黑色素瘤患者中cystatin C與預(yù)后關(guān)系，未發(fā)現(xiàn)兩者之間存在相關(guān)性。

我們用單因素Cox回歸分析發(fā)現(xiàn)Cat X水平以及TNM分期是影響肺癌預(yù)后獨(dú)立因素，Cat X高水平以及晚期肺癌患者預(yù)后更差。多因素回歸分析表明分期是影響肺癌患者生存的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，晚期患者預(yù)后更差、OS更短，死亡的風(fēng)險(xiǎn)是早期的2.250倍。我們的結(jié)果進(jìn)一步佐證了晚期肺癌預(yù)后更差。

總之，我們的研究初步證明在肺癌患者中血清Cat X和cystatin C水平升高，可能與肺癌的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。cystatin C在晚期肺癌中表達(dá)增高，可能與肺癌轉(zhuǎn)移、侵襲相關(guān)。Cat X高水平的患者OS更短，單因素Cox回歸分析顯示Cat X是影響肺癌患者預(yù)后的獨(dú)立因素。但本研究樣本量還不大，需要擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步研究Cat X等因子與肺癌臨床特征及預(yù)后的關(guān)系。