古柏樹新病原菌—擬黃薄孔菌分析鑒定

商圓圓，張恩奎，孫曉琳，霍存錄，馮 望，吳 穎，賀新生

(1.西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，四川 綿陽 621010;2.金堂縣林業(yè)局，四川 金堂 610400)

柏樹(Cupressus funebris Endl.)為常綠喬木，屬于柏科(Cupressaceae)，柏木屬(Cupressus)［1］，有 22屬約150種，中國有8屬30種，是我國亞熱帶代表性針葉樹種之一［2］。由于柏科植物對氣候和土壤有很強(qiáng)的適應(yīng)能力，自然分布廣，樹干直，適應(yīng)性廣，在山地綠化、防風(fēng)固沙及水土保持等方面起著重要作用［3］，此外很多古柏樹林，歷經(jīng)千年滄桑而仍完好茂盛，生機(jī)盎然，例如由近萬株森森古柏組成的翠云廊，現(xiàn)在已經(jīng)成了著名的風(fēng)景旅游區(qū)［4］。這些千年古柏同樣也面臨著越來越多的病蟲及病原真菌的威脅，現(xiàn)在非常有必要及時對這些柏樹的威脅因素進(jìn)行較為深刻的認(rèn)識和研究［7］。

近年來，筆者在四川省劍閣縣、江油市、梓潼縣、都江堰市等地的漢代古柏樹上發(fā)現(xiàn)了一種新的病原真菌，引起古柏樹樹根和樹干褐腐病，最終導(dǎo)致樹木枯死。該菌屬于菌物界(Fungi)，擔(dān)子菌門(Basidiomycota)，傘菌亞門 (Agaricomycotina)，傘菌綱(Agaricomycetes)，多孔菌目(Polyporales)，擬層孔菌科(Fomitopsidaceae)，薄孔菌屬(Antrodia P.Karst)。在形態(tài)學(xué)分析的基礎(chǔ)上，本文利用分子系統(tǒng)學(xué)方法對其構(gòu)建同源樹，以更加客觀準(zhǔn)確地判定其是否為一新種，也更加直觀的分析擬黃薄孔菌的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。由于擬黃薄孔菌對柏木有著很強(qiáng)的腐朽作用，所以對于古柏和木材質(zhì)量的保護(hù)也要相應(yīng)的提高，從而警惕類似病原真菌的侵入和防治。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

擬黃薄孔菌子實(shí)體，2010年5月3日由賀新生教授采集于四川省劍閣縣翠云廊張飛井旁的柏樹枯木上。標(biāo)本保存在西南科技大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室，編號為:164。

表1 供試菌株及其ITS序列登錄號Table 1 The ITS accession number of test strains from GenBank

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 形態(tài)學(xué)觀察

首先對采集的子實(shí)體進(jìn)行形態(tài)觀察。組織分離得到純菌種，挑取少量菌肉于PDA基礎(chǔ)培養(yǎng)基上，在25℃進(jìn)行活化培養(yǎng)，然后挑取部分菌絲接種于含有PDA基礎(chǔ)培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿上，25℃下培養(yǎng)，觀察菌落形態(tài)。最后將菌絲置于光學(xué)顯微鏡下觀察其菌絲的形態(tài)結(jié)構(gòu)。

1.2.2 獲得 ITS序列

首先，提取總脫氧核糖核酸(Deoxyribonucleic acid，DNA)，采用十六烷基三甲基溴化銨法(Hexadecyltrimethy Ammonium Bromide，CTAB)，用 Lifefeng DNA純化試劑盒進(jìn)行純化，1.0%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測。然后以總DNA為模板，ITS1和ITS4為引物進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)(Polymerase Chain Reaction，PCR)反應(yīng)。采用 25 μL 的反應(yīng)體系:2.5 μL 10×buffer，2.0 μL 4 種 dNTP 混合物，ITS1 和 ITS4引物各 2.0 μL，0.5 μL TagDNA 聚合酶，1.5 μL Mg2+，12.5 μL ddH2O，2.0 μL DNA 模板。反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性5 min，94℃變性40 s，55℃退火50 s，72℃延伸50 s，72℃ 延伸10 min，循環(huán)35次，4℃保存。1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測產(chǎn)物。將理想的PCR產(chǎn)物寄送到生工生物工程(上海)有限公司進(jìn)行測序，獲得所需的ITS序列數(shù)據(jù)。

1.2.3 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹

將已經(jīng)獲得的擬黃薄孔菌的ITS序列，在Gen-Bank通過NucleiBlast軟件搜索出與之高相似的相關(guān)物種的ITS序列。然后利用DNAMAN(6.0.3.99版本)對所有的序列進(jìn)行比對和構(gòu)建同源樹，確立擬黃薄孔菌的分類學(xué)地位和系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。最終確定其物種后，將擬黃薄孔菌的ITS序列上傳到NCBI數(shù)據(jù)庫，并獲得序列號。

2 結(jié)果與分析

2.1 子實(shí)體和菌絲的形態(tài)特征

該菌春夏秋季發(fā)生在柏樹樹干枯朽部位、樹干基部樹皮，樹根上，當(dāng)年連續(xù)生長。如圖1，擔(dān)子果1 a生，平伏貼生，易與基質(zhì)分離。新鮮時脆蠟質(zhì)、軟木質(zhì)，干燥后變硬、脆，整體鮮黃色，易開裂成不規(guī)則的片狀。菌管表面鮮黃色，干燥后變?yōu)辄S白色、黃色，長3 mm～4 mm;菌管層黃色、黃白色，分層不明顯，粉筆質(zhì)，不易與菌肉分離，非放射狀。孢子印白色。擔(dān)孢子臘腸形、彎圓柱形，略彎曲，無色，薄壁，光滑，與Melzer和棉蘭試劑均無變色反應(yīng)，大小為2～3.5 ×0.8 ～1.0 μm。

圖1 擬黃薄孔菌子實(shí)體形態(tài)Fig.1 The morphology of the fruiting bodies of Antrodia subxantha

菌絲系統(tǒng)3型，生殖菌絲，具鎖狀聯(lián)合，薄壁，通常分枝，交織排列，直徑2 μm ～2.5 μm;骨架菌絲占多數(shù)，厚壁，扭曲，常分枝，強(qiáng)烈交織排列，直徑5 μm～6 μm，纏繞菌絲尖細(xì)，分枝發(fā)達(dá)，直徑 0.5 μm ～1.5 μm。菌管菌絲與菌肉菌絲相似。

培養(yǎng)特征如圖2，在瓊脂培養(yǎng)基上菌絲先稀疏，呈白色、黃白色，后變密集、鮮黃色、黃色，菌絲具有爬壁性，可以直接形成子實(shí)體。菌絲具有明顯的鎖狀聯(lián)合。

圖2 擬黃薄孔菌菌落及菌絲體形態(tài)Fig.2 The colony morphology and mycelium form of Antrodia subxantha

2.2 系統(tǒng)發(fā)育樹分析

將擬黃薄孔菌的ITS序列(632bp)轉(zhuǎn)化成Fast格式，并上傳至GenBank，通過Blast比對，獲得最大相似序列(表1)，并將已測序列上傳至NCBI數(shù)據(jù)庫，獲得的序列號JN182921。然后結(jié)合已報道的擬黃薄孔菌的物種的ITS序列，利用ClustalX進(jìn)行多重比對，最后用 DNAMAN(6.0.3.99 版本)軟件對這12個供試菌株的ITS rDNA序列進(jìn)行分析，得到系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3)可看出，擬黃薄孔菌在分子系統(tǒng)的分析中屬于薄孔菌屬(Antrodia)，且較明顯的區(qū)別于其它的菌株，單獨(dú)聚類為一種。與已知的西加薄孔菌(Antrodia sitchensi)和黃薄孔菌(Antrodia xantha)的同源相似度為94%。

圖3 基于擬黃薄孔菌的ITS同源性分析Fig.3 Phylogeny and relationships of Antrodia sp.based on ITS sequences

3 討論

擬黃薄孔菌Antrodia subxantha Y.C.Dai＆ X.S.He.屬于菌物界(Fungi)，擔(dān)子菌門(Basidiomycota)，擬層孔菌科(Fomitopsidaceae)，薄孔菌屬(Antrodia P.Karst)。在系統(tǒng)進(jìn)化樹中將12種薄孔菌物種聚為了四大類，其中擬黃薄孔菌以94%的相似度與細(xì)加薄孔菌 Antrodia sitchensis(Baxter)Gilb.＆Ryvarden聚類在一起，依據(jù)ITS序列的分類標(biāo)準(zhǔn)可判定二者為不同種。雖然在子實(shí)體形態(tài)上與黃薄孔菌Antrodia xantha(Fr.)Ryvarden和西加薄孔菌Antrodia sitchensis最相似，但該種子實(shí)體顏色更加鮮艷，為亮黃色，完全平伏貼生，沒有發(fā)現(xiàn)形成層架狀、蹄狀的子實(shí)體。且顯微觀察發(fā)現(xiàn)該種孢子(大小為2～3.5 ×0.8 ～1.0 μm)明顯小于黃色薄孔菌和西加薄孔菌，其中黃色薄孔菌孢子大小為4.2～5.0×1.2 μm，西加薄孔菌的孢子大小為4.5～5.5×1.8～ 2.2 μm［8～11］。

此外薄孔菌屬中的大部分的物種的菌絲系統(tǒng)為二體型，分為生殖菌絲和骨架菌絲，而擬黃薄孔菌的菌絲為3型菌絲系統(tǒng)，具有生殖菌絲，菌管菌絲和菌肉菌絲，其中骨架菌絲與菌肉菌絲相似。擬黃薄孔菌在江油市六合鄉(xiāng)、梓潼縣七曲山大廟，成都青城山、綿陽江油市和梓潼縣的古柏樹上也均發(fā)現(xiàn)有存在，樹齡超過1500 a～2000 a，一般生長在柏樹樹枝、樹根、樹皮還有枯樹樁上，對于柏木的腐蝕能力強(qiáng)，在樹根和樹干表面引起褐色腐朽，最后導(dǎo)致全株植物枯死。可見其對于柏樹生長和木材質(zhì)量的影響比較廣泛的，所以今后要加強(qiáng)對該種菌生長條件觀察和防治方法的研究，為古柏名木的保護(hù)提供必要的科學(xué)依據(jù)。

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