骨髓源性血管內(nèi)皮祖細胞的分離培養(yǎng)及鑒定

韓瑩，施鵬，王奕丹，閆青爽，韓清，吳璠，張玲*

(1.沈陽醫(yī)學院基礎醫(yī)學院病理教研室，遼寧 沈陽 110034;2.沈陽醫(yī)學院奉天醫(yī)院婦科;3.沈陽醫(yī)院基礎醫(yī)院2011級臨床醫(yī)學專業(yè)4班;4.沈陽市文官屯95979部隊衛(wèi)生教研室)

自從Asahara等首次報道外周血存在內(nèi)皮祖細胞 (endothelial progenitor cells，EPCs)且具有分化為成熟內(nèi)皮細胞的潛力以來，對EPCs促進血管再生的研究，尤其是組織缺血所致?lián)p傷后局部EPCs的增殖分化遷移更是倍受青睞［1］。然而EPCs在缺血局部的增殖分化遷移回歸巢數(shù)量從目前實驗研究結果看尚不理想，為此，本實驗旨在通過觀察由大鼠骨髓單個核細胞分離，體外誘導培養(yǎng)EPCs的生長過程，對其進行鑒定，建立一套重復性好、純度高的培養(yǎng)方法，從而為EPCs下一步研究打下基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 3～4周齡Wistar雄性大鼠，體重300～400 g，中國醫(yī)科大學實驗動物中心提供。纖維連接蛋白 (FN)(美國BD公司)，優(yōu)級胎牛血清(FBS，杭州四季青公司)，EGM培養(yǎng)基試劑盒(美國 Cloncties公司)，血管內(nèi)皮細胞生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF) (美國Peprotech公司)，堿性成纖維細胞生長因子 (basic fibroblast growth factor，bFGF)(美國 Peprotech公司)，兔抗CD34單克隆抗體、兔抗CD133單克隆抗體 (北京博奧森公司)，兔抗Ⅷ多克隆抗體 (武漢博士德公司)，大鼠淋巴細胞分離液 (天津灝洋公司)，SP試劑盒、兔抗山羊 IgG FITC(Santa Cruz)。

1.2 方法

1.2.1 EPCs的分離培養(yǎng) (1)骨髓細胞的獲?。侯i椎脫臼法處死大鼠，75%酒精浸泡消毒后無菌操作，取大鼠股骨、脛骨，將其移入培養(yǎng)液內(nèi)，使其完全浸入防止凝固。用10 ml注射器抽吸培養(yǎng)液，從骨髓腔一端向另一端反復吹打，直至骨髓腔呈白色。(2)單個核細胞的分離：將細胞混懸液移入試管，1 000 r/min離心10 min。在另一試管中加入淋巴分離液 (密度1.083)5 ml。細胞混懸液分離后，棄上清，加入PBS 5 ml并充分吹打混勻。將該細胞混懸液用吸管在淋巴分離液上方2～3 cm處沿管壁緩緩加入盛有淋巴分離液的試管，使二者體積比為1∶1，2 000 r/min離心20 min。用吸管輕輕插到白膜層，沿管壁周緣輕輕吸取白膜。將白膜層吸入另一試管，加入PBS液5 ml，混勻后1 000 r/min離心10 min。(3)單個核細胞計數(shù)：離心后棄上清，加入PBS液3 ml，混勻后吸出100 μl，加入 PBS液2 ml中 (1∶20稀釋)，按公式：3 ml溶液所含細胞總量=鏡下4個中方格細胞總數(shù)÷4×20(稀釋倍數(shù)) ×3(液體總量) ×104，計算分離所得細胞總數(shù)。同時在試管內(nèi)追加 PBS液2 ml，1 000 r/min離心10 min。(4)EPCs接種培養(yǎng)：離心后棄全部上清，分別加入1 ml常規(guī)EPCs培養(yǎng)液與特殊EPCs培養(yǎng)液 (含地塞米松和維生素C)中各自混勻，根據(jù)計數(shù)結果，吸相應數(shù)量的細胞混懸液到3 ml培養(yǎng)基中，使各自細胞濃度均達到4×106/ml，然后將細胞接種到24孔板上，每孔0.5 ml(1×106/cm2)。放入37℃、5%CO2、飽和濕度100%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。48 h半量換液，以后每3 d半量換液1次。(5)EPCs的消化及計數(shù)：細胞生長第7天，取出培養(yǎng)板，先將培養(yǎng)液吸出，D－Hank's液洗2遍，加入0.25%胰酶、0.02%EDTA各0.5 ml，放培養(yǎng)箱3～5 min，并隨時倒置顯微鏡下觀察，多數(shù)細胞突起回縮、變圓時，及時用等量含胎牛血清的培養(yǎng)液終止消化，移入試管，再用D－Hank's液輕輕吹打培養(yǎng)板上仍貼壁細胞2遍，將洗滌液一同加入試管，1 000 r/min離心10 min。棄上清，PBS洗2遍后，加入1 ml PBS液，顯微鏡下計數(shù)細胞數(shù)目，移植備用。另取部分細胞加入培養(yǎng)液爬片鑒定。(6)EPCs的爬片和鑒定：將細胞懸液接種到放有玻片 (預先鋪一層FN)的6孔板中爬片，在37℃、5%CO2、飽和濕度95%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，各孔加入PBS洗2遍，取出玻片，4%多聚甲醛固定15 min，再用PBS洗2遍，干燥后，－20℃冰箱保存或直接免疫組化鑒定。

1.2.2 EPCs鑒定

1.2.2.1 細胞形態(tài)學鑒定及生長曲線測定 通過光學顯微鏡觀察誘導培養(yǎng)1、7、15 d的細胞形態(tài)學變化。將原代 EPCs制備細胞懸液，以5×103個/孔的密度接種于包被FN的96孔板中，每孔體積200 μl。從1～14 d，隔日隨機抽取4個培養(yǎng)孔，每孔加入MTT溶液 (5 g/L)20 μl，37℃繼續(xù)孵育4 h，終止培養(yǎng)，吸出孔內(nèi)上清，每孔加入100 μl DMSO，振蕩10 min，使結晶能充分溶解。選擇490 nm波長比色，在酶聯(lián)免疫檢測儀上測定各孔OD值，以時間為橫軸，吸光值為縱軸，繪制細胞生長曲線。設不加細胞只加培養(yǎng)液的為空白對照孔。

1.2.2.2 免疫組化鑒定 將由FN包被培養(yǎng)4、7、9、14 d的細胞爬片，爬滿后PBS洗滌，10%中性甲醛固定，按SP試劑盒的說明操作，分別滴加CD34、CD133、vWF、ⅧF一抗，DAB染色，陽性細胞呈棕黃色。用PBS作陰性對照。

1.2.2.3 內(nèi)皮祖細胞吞噬功能的鑒定 取消化培養(yǎng)的細胞懸液離心 (4℃，300 r/min，6 min)后去上清，用加入5 ml培養(yǎng)液稀釋并計數(shù);在細胞懸液中加入12.5 pg(密度：2.5 pg/mL)的DilacLDL在37℃孵育1h，然后用2%多聚甲醛固定細胞10 min，PBS 洗后加入 50 μg(密度：10 μg/ml) 的FITC－UEA－l，37℃孵育1 h后，激光共聚焦顯微鏡觀察。Dil－acLDL 和 FITC－UEA－1，雙染色陽性細胞(黃色)被認為是正在分化的EPCs。

2 結果

2.1 EPCs形態(tài)變化及生長狀況 培養(yǎng)4 d換液去除未貼壁細胞后，細胞形態(tài)多為短梭型或多角形;培養(yǎng)7 d，梭型細胞較前增多，形成細胞團，可見集落形成;10 d可見細胞形成索狀或網(wǎng)狀血管樣結構;14 d時，細胞呈鵝卵石樣外觀，見圖1。

2.2 免疫組化鑒定 按照上述方法對培養(yǎng)細胞進行免疫組化鑒定，結果顯示：CD133(+)，CD34(+)，ⅧF(++)，vWF(+)。見圖2。

2.3 EPCs 攝 取 DiL－acLDL，結 合 FITC－Lectin－UEA－1的實驗 培養(yǎng)細胞胞漿攝取DiL－acLDL呈紅色，胞膜結合 FITC－Lectin－UEA－1呈綠色，正在分化的EPCs為黃色。見圖3。

圖3 培養(yǎng)細胞攝取DiL－acLDL呈紅色 (a)，結合FITC－Lectin－UEA－1呈綠色 (b)，正在分化的EPCs為黃色 (c)免疫熒光染色(×200)

2.4 大鼠骨髓來源EPCs原代培養(yǎng)生長曲線分析

大鼠骨髓單個核細胞接種后，前3 d細胞數(shù)量變化不大，生長較緩慢，為生長的潛伏期，5～8 d細胞生長增殖速度加快，并形成集落，為對數(shù)生長期，9 d后，細胞基本鋪滿培養(yǎng)板底部，進入生長平臺期。見圖4。

圖4 EPCs生長曲線

3 討論

目前已知，血管再生主要由血管新生 (angiogenesis)與血管發(fā)生 (vasculogenesis)兩部分構成，血管新生是指從原有血管的成熟內(nèi)皮細胞的增殖和遷移，以出芽或分裂的方式長出新的毛細血管的過程;血管發(fā)生則是指通過來自于循環(huán)中的骨髓起源EPCs，聚集到新生血管的部位并在原位分化為血管內(nèi)皮細胞，并形成血管的過程［2］。EPCs的增殖分化遷移的潛能及參與組織缺血或損傷后的歸巢、血管新生的作用使其在各種缺血性疾病、血管性損傷以及腫瘤的診治方面，有著廣泛的應用前景，進一步深入研究EPCs有可能為這些疾病治療開辟新的思路。

從現(xiàn)有研究成果來看，EPCs尚無特異性的表面標志，但不同來源、不同發(fā)育階段的EPCs卻具有不全相同的表面標志。EPCs分化早期主要表達CD34和CD133。CD34是干細胞抗原，除表達于造血干細胞外，在成熟內(nèi)皮細胞也有低水平表達。它的功能可能是作為造血和內(nèi)皮前體細胞相互作用的黏附分子，CD34缺失會導致造血和血管形成缺陷;CD133主要表達于造血干細胞和一些前體細胞，其確切功能尚不清楚，CD133+細胞具有分化為包括內(nèi)皮細胞在內(nèi)的多種細胞的能力。隨著EPCs向成熟內(nèi)皮細胞分化，CD133快速丟失，所以CD133對于鑒定內(nèi)皮細胞和EPCs具有較高特異性［3］。

利用EPCs表面CD34、CD133標志對單個核細胞進行分選，在含有促進內(nèi)皮細胞生長因子的培養(yǎng)基中培養(yǎng)可獲得純度較高的細胞。但由于缺乏特異的EPCs表面標志，對其判定仍有爭議。有學者認為CD34+細胞并不是真正的EPCs，而只是可以調節(jié)血管形成。而且，體外實驗表明只有CD34+和CD34－細胞共同培養(yǎng)時，才能形成血管樣結構。CD34+和CD34－細胞共同移植于血管損傷動物體內(nèi)，比任何一種細胞單獨移植都會產(chǎn)生更多的新血管。因此，CD34+可能并不是EPCs的一個關鍵表面標志。最近還有研究表明EPCs也可能存在于 CD34－和 CD133－單核細胞群［4］，F(xiàn)riedrich 等從 CD34+/CD133+/VEGFR－2+前體細胞中分離出 EPCs，而 Kim等［6］從臍血 CD133+/CD14+細胞中分離出EPCs。鑒于此，本實驗采用貼壁培養(yǎng)法進行大鼠骨髓EPCs培養(yǎng)。

體外培養(yǎng)過程中，EPCs對周圍微環(huán)境的要求很高，除了對細胞分離液密度有嚴格要求外，對單個核細胞懸浮液的離心速度也非常重要，離心速度過快易使細胞受損，碎片增多成活細胞減少，離心過慢則會使單個核細胞與其它細胞混雜，細胞純度降低。因此掌握適當?shù)碾x心速度也是EPCs培養(yǎng)的關鍵。另外VEGF作為定向分化依賴的特定細胞因子，通過其高親和力受體作用于內(nèi)皮系細胞，促進其分裂、增殖和遷移，在EPCs的培養(yǎng)中亦不可或缺。

在培養(yǎng)中我們還發(fā)現(xiàn)，單個核接種密度對細胞的生長很重要，當接種密度為1×106/cm2時細胞貼壁和分化較理想，這說明干細胞的增殖與分化依賴于細胞之間的相互作用，一定的接種密度允許細胞間充分的促進作用又不至于過分消耗養(yǎng)分或產(chǎn)生抑制。采取半量換液要比全部換液細胞生長好，這說明細胞可能分泌了一些未知的細胞因子促進了內(nèi)皮祖細胞的生長與分化。貼壁對于EPCs的培養(yǎng)也非常重要，盡管常用的促貼壁物質有FN、明膠和貼壁因子等，但由于FN的高糖可增強細胞間黏連、細胞與基質的黏連，還通過細胞信號轉導途徑調節(jié)細胞的形狀和細胞骨架的組織，促進細胞鋪展。因此我們選用PBS稀釋后的FN包被培養(yǎng)板，更有利于細胞的貼壁，有利于骨髓的單個核細胞向EPCs方向發(fā)展。

文獻中應用EPCs進行實驗的時間多為培養(yǎng)后7 d左右，鑒定也多于此時間段進行。EPCs的鑒定缺乏特異標準，應用流式細胞儀進行表型特征鑒定是常用方法之一。一般認為，EPCs表型特征包括：CD34+/CD133+/KDR+(VEGF－2)。但因三者皆為陽性的細胞數(shù)稀少，研究中多采用CD34+/CD133+、 CD34+/KDR+(VEGF－2) 或CD133+/KDR+(VEGF－2) 細胞作為 EPCs的標志。另一種常用的鑒定方法為攝取DiL－acLDL和結合 FITC－UEA－1實驗，免疫熒光檢測 DiL－acLDL和FITC－UEA－1雙陽性的細胞為正在分化的EPCs。本實驗中骨髓單個核細胞培養(yǎng)7 d后，應用DiL－acLDL和FITC－UEA－1免疫熒光染色后，雙陽性細胞＞90%，10 d時，雙陽性細胞仍＞80%，為正在分化的EPCs，說明本實驗所用方法可獲得較高純度的EPCs。無論是骨髓還是外周血EPCs含量都極少，在應用EPCs應用于疾病治療的前提條件是進行體外擴增。本實驗細胞培養(yǎng)至第7天時，EPCs的數(shù)量等級為106，可以達到實驗研究的需要。

目前，EPCs的分離培養(yǎng)尚無統(tǒng)一的標準，不同實驗室分離和培養(yǎng)的EPCs方法條件差異較大，所培養(yǎng)的細胞表型特征和分化潛能亦有差別。本實驗建立了一套較成熟的分離、培養(yǎng)以及鑒定大鼠骨髓來源的EPCs的方法，為進一步研究提供了實驗基礎和理論依據(jù)。

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