ANGPTL4基因表達和血管生成與胃癌發(fā)展的關系

趙劍鋒 陳金坤▲ 林麗娟 蔡清河 鄭龍志 陳建新

1.莆田學院附屬醫(yī)院普外科，福建莆田 351100；2.莆田學院附屬醫(yī)院胸外科，福建莆田 351100

胃癌是高發(fā)的消化道惡性腫瘤，并具有早期多發(fā)轉(zhuǎn)移的生物學特性，腫瘤的進展與多種因素有關，由于高代謝狀態(tài)促使其對血供需求劇增，而新生血管形成在腫瘤的生長、浸潤、轉(zhuǎn)移過程中起關鍵作用。血管生成素樣蛋白4是一種新發(fā)現(xiàn)的血管生成相關因子，2002年被國際人類基因組織命名為ANGPTL4，其基因和蛋白具有與血管生成素相似的結(jié)構(gòu)和功能[1]。近年來研究發(fā)現(xiàn)其廣泛存在與內(nèi)臟器官組織細胞中，與血管內(nèi)皮細胞遷移、管狀成形及血管重新分布有關[2-3]。本研究通過觀察胃癌組織中ANGPTL4基因的表達及其與血管生成和腫瘤發(fā)展的關系，探討其在胃癌發(fā)展中的作用，為臨床早期預防提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2011年2月～2012年2月本院行胃賁門癌手術治療患者50例的病理組織標本為實驗組，男28例，女22例，年齡 33～75 歲，平均（56.93±10.37）歲，術前均未經(jīng)化療、放療或免疫治療。病理檢驗證實均為腺癌，組織病理分級：低分化14例，中分化20例，高分化16例；臨床分期按國際抗癌協(xié)會（UICC）TNM標準：Ⅰ期11例、Ⅱ期20例、Ⅲ期10例、Ⅳ期9例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移26例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移24例；浸潤淺肌層16例，浸潤深肌層22例，浸潤漿膜層12例。每例患者均選擇腫瘤組織及手術切緣組織標本。另選擇同期我院電子胃鏡活檢胃潰瘍旁正常胃黏膜組織10例作為對照組，男6例，女4例，年齡 35～72歲，平均（55.86±10.45）歲。

1.2 試劑與儀器

人ANGPTL4單克隆抗體、鼠抗人CD34單克隆抗體、免疫組化試劑盒購自均購自北京中杉金橋生物技術有限公司；原位雜交預雜交液，NBT/BCIP，原位雜交5'端生物素標記ANGPTL4 mRNA探針購自上海瑞齊生物科技有限公司。美國雅培ThermoBrite S500型原位雜交儀，奧林巴斯FV1000激光共聚焦顯微鏡。

1.3 研究方法

1.3.1 原位雜交技術檢測ANGPTL4 mRNA

標本切片常規(guī)進行脫蠟、梯度酒精脫水、H2O2預孵、蛋白酶消化，滴加20 μL預雜交液處理4 h，加入含ANGPTL4基因熒光標記探針、探針緩沖液、超純水配制的混合液10 μL，置雜交儀中，于73℃變性5 min，37℃雜交12 h，洗脫液浸泡、洗滌，NBT/BCIP染色，避光顯色2～3 h[4]。以陽性結(jié)果胃癌組織作為陽性對照，不含探針標本為陰性對照。

1.3.2 免疫組化染色法檢測微血管密度（MVD）

標本切片脫蠟、H2O2預孵、漂洗、高溫高壓修復抗原，按照免疫組化試劑盒說明采用鏈霉素親和素-生物素-過氧化物酶復合物技術（SABC）以CD34標記血管染色[5]。以試劑盒公司提供的陽性樣本作為陽性對照，PBS替代一抗為陰性對照。

1.4 結(jié)果判定

ANGPTL 4 mRNA陽性判定：激光共聚焦顯微鏡觀察雜交信號并進行計數(shù)，細胞質(zhì)ANGPTL 4 mRNA信號于細胞質(zhì)內(nèi)呈淺黃色至棕黃色顆粒陽性，隨機選取5個細胞數(shù)＞200個的高倍視野，按染色強度及陽性細胞占比進行結(jié)果判定，染色強度由陰性～棕黃為0～3分；陽性細胞占比＜10%為1分，10%～50%為2分，＞50%為3分；后將兩者得分相乘計算總分，總分≥3為陽性，＜3為陰性。MVD陽性判定：染色呈棕色的1個內(nèi)皮細胞或成群無官腔細胞簇均計為微血管，管徑＞50 μm及肌層較厚者不計為微血管，隨機選取5個細胞數(shù)＞200個的高倍視野計數(shù)微血管數(shù)，5個區(qū)域微血管計數(shù)均值作為MVD值。

1.5 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 17.0統(tǒng)計學軟件進行分析，計數(shù)資料采用卡方檢驗，計量資料以均數(shù)±標準差表示，兩獨立樣本比較采用t檢驗，多樣本比較采用F檢驗，兩兩比較采用q檢驗，等級資料相關性采用Spearman等級相關分析，兩變量間直線相關性采用Pearson相關分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 胃癌組織、癌旁組織和正常胃黏膜ANGPTL 4 mRNA表達及MVD計數(shù)

ANGPTL 4 mRNA在胃癌組織中高表達，癌旁組織中存在一定的陽性表達，而正常胃黏膜陽性率較低，陽性率為胃癌組織＞癌旁組織＞正常胃黏膜，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。MVD計數(shù)在胃癌組織中顯著升高，為胃癌組織＞癌旁組織＞正常胃黏膜，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。見表 1，圖 1、2。

2.2 ANGPTL 4 mRNA表達及MVD計數(shù)的關系

ANGPTL 4 mRNA表達強度與MVD計數(shù)之間呈一定的相關趨勢（圖3），經(jīng)Pearson相關分析，兩者呈正相關（r=0.63，P ＜ 0.05）。

2.3 ANGPTL 4 mRNA表達與胃癌臨床特征關系

胃癌組織中ANGPTL 4陽性表達率與MVD計數(shù)與年齡、性別無關，與組織病理分級、TNM分期、浸潤深度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關（P＜0.05），經(jīng)Spearman等級相關分析ANGPTL 4陽性表達與組織病理分級、TNM分期、浸潤深度呈正相關 （r=0.61，0.59，0.65，P ＜ 0.05），MVD 計數(shù)與組織病理分級、TNM分期、浸潤深度呈正相關（r=0.57，0.56，0.60，P ＜ 0.05），見表 2。

表1 胃癌組織、癌旁組織和正常胃黏膜ANGPTL 4 mRNA表達及MVD計數(shù)

3 討論

ANGPTL 4是分泌型糖蛋白ANGPTL家族的一員，其主要表達于惡性腫瘤壞死病灶邊緣[1-6]，并且在體內(nèi)、外環(huán)境中對惡性腫瘤的作用仍存在爭論。韓杰等[7]通過體外轉(zhuǎn)染檢測，發(fā)現(xiàn)ANGPTL 4基因的表達對大腸癌細胞HT29的遷移及偽足形成有抑制作用。曾一元等[8]認為ANGPTL 4基因?qū)Ω伟〩uh-7細胞體外增殖有抑制作用并抑制其裸鼠體內(nèi)成瘤，但對MHCC-LM3細胞和MHCC-97L細胞的體外增殖有促進作用并促進其體裸鼠內(nèi)成瘤。但其對血管內(nèi)皮細胞的遷移、侵襲和管狀成形的作用基本得到認同[9-10]。

本研究選取了50例胃腺癌組織標本進行ANGPTL 4 mRNA及MVD測定，結(jié)果顯示ANGPTL 4 mRNA在胃癌組織中顯著高表達，陽性率為82.0%，腫瘤手術切緣作為癌旁組織的標本中ANGPTL 4 mRNA存在陽性表達，但陽性率顯著降低，而在正常胃黏膜對照標本中，其表達率較癌旁組織顯著降低，三種組織類型中ANGPTL 4 mRNA陽性表達率之間差異有統(tǒng)計學意義。表明ANGPTL 4 mRNA在正常胃黏膜中陽性表達率較低，其存在和高表達與胃癌發(fā)展有關。而Klopper JP等[11]研究認為ANGPTL 4基因在胃癌MKN28和MKN74兩個細胞系及原位胃癌組織中表達下降，與本研究的差異可能與胃癌組織學分類及標本所處腫瘤部位選擇不同有關，并有待進一步研究證實。通過計數(shù)三種組織標本中的MVD結(jié)果顯示，其在胃癌組織中計數(shù)顯著升高，同時癌旁組織中計數(shù)也顯著高于正常胃黏膜組織。進一步分析ANGPTL 4 mRNA表達強度與MVD計數(shù)的關系顯示，兩者呈現(xiàn)顯著的正相關，MVD計數(shù)隨則ANGPTL 4 mRNA表達增強而增多，ANGPTL 4 mRNA對微血管的增殖、形成有明顯的促進作用，而微血管大大量增加為腫瘤細胞提供所需的血液供應，并為其進一步浸潤侵襲，血液轉(zhuǎn)移提供前提。因此可以想見ANGPTL 4 mRNA的高表達與胃癌腫瘤細胞的浸潤、轉(zhuǎn)移之間關系密切。

表2 ANGPTL 4 mRNA表達及MVD計數(shù)與胃癌臨床特征關系

本研究通過對胃癌患者臨床病理學特征與ANGPTL 4 mRNA表達的分析結(jié)果顯示，在不同年齡和性別的胃癌患者胃癌組織中ANGPTL 4 mRNA表達無顯著差異，但ANGPTL 4 mRNA表達則表現(xiàn)出與組織病理分級、TNM分期、浸潤深度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的密切相關性，低分化腺癌組織中ANGPTL 4 mRNA陽性率顯著升高，并明顯高于中分化和高分化腺癌組織，呈現(xiàn)與組織病理分級的正相關，表明惡性程度越高其ANGPTL 4 mRNA表達越強，其對血管生成的影響越明顯以滿足腫瘤細胞的增殖、生長所需供養(yǎng)[12-13]。胃癌細胞浸潤深度體現(xiàn)了其侵襲性，而浸潤至深肌層，甚至漿膜層的胃癌組織中ANGPTL 4 mRNA表達顯著升高，表明ANGPTL 4可能對胃癌細胞遷移功能和偽足的形成有促進作用[14]。同時ANGPTL 4 mRNA的高表達也與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移關系密切，其與胃癌多發(fā)轉(zhuǎn)移有關，還可能促進微淋巴管內(nèi)皮細胞增殖、管狀形成[15]。其與臨床TNM分期關系與以上結(jié)果相應，而對胃癌組織中MVD計數(shù)與臨床病理學特征的關系分析顯示，MVD計數(shù)與病理學特征的關系與ANGPTL 4相似。表明ANGPTL 4 mRNA在胃癌發(fā)展過程中起促進作用，可能是通過促進微血管生成來達到。

綜上所述，ANGPTL 4在體內(nèi)胃癌組織中的表達升高，其促使微血管通道形成的作用，對胃癌細胞的增殖、生長提供充足營養(yǎng)，促進胃癌細胞侵襲性，并為腫瘤轉(zhuǎn)移提供途徑通道。應進行動物體內(nèi)、外實驗以進一步明確其在胃癌發(fā)展中的作用機制和生物學特性。

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