注射用鹽酸胺碘酮細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法研究

陳 琪 許姿敏

廣東省食品藥品檢驗(yàn)所藥理室，廣東廣州 510180

注射用鹽酸胺碘酮屬為抗心絞痛藥，能選擇性擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈血流量，同時(shí)減少心肌耗氧量，減慢心率，降低房室傳導(dǎo)速度，與β-受體阻滯劑的效應(yīng)相似。用于室上性和室性心動(dòng)過速、陣發(fā)性心房撲動(dòng)和顫動(dòng)、預(yù)激綜合征，也可用于頑固性陣發(fā)性心動(dòng)過速、慢性冠狀動(dòng)脈功能不全及心絞痛等[1-2]。當(dāng)不宜口服給藥時(shí)應(yīng)用本品治療嚴(yán)重的心律失常，尤其適用于下列情況：房性心律失常伴快速室性心律、W-P-W綜合征的心動(dòng)過速和嚴(yán)重的室性心律失常[3]。本文根據(jù)《中華人民共和國(guó)藥典》（簡(jiǎn)稱《中國(guó)藥典》）2010年版二部附錄ⅪE“細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法”中所述的藥品細(xì)菌內(nèi)毒素的檢查方法及其干擾試驗(yàn)的基本原理，對(duì)注射用鹽酸胺碘酮的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查進(jìn)行了研究[4]。本文列出了相同廠家3個(gè)不同批次的樣品在不同廠家鱟試劑（TAL）下的干擾試驗(yàn)數(shù)據(jù)，闡明了對(duì)注射用鹽酸胺碘酮進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查的可行性，進(jìn)一步建立了細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法。現(xiàn)報(bào)道如下：

1 儀器與試劑

1.1 儀器

旋渦振蕩器 （IKA-MS-1）；恒溫水浴箱 （德國(guó)Julabo 19A）。

1.2 試劑

細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用鱟試劑 （靈敏度：0.125 EU/mL；規(guī)格：0.1 mL/支；批號(hào)：1011181）、BET 水（批號(hào)：1101040；規(guī)格：5.0 mL/支），購(gòu)于廣東湛江安度斯生物有限公司。細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用鱟試劑（靈敏度：0.125 EU/mL；規(guī)格：0.1 mL/支；批號(hào)：1102130）購(gòu)于廣東湛江博康海洋生物有限公司。細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品（批號(hào)：150601-201174；效價(jià)：160 EU/支）購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。

2 實(shí)驗(yàn)方法及結(jié)果

2.1 鱟試劑靈敏度（λ）的復(fù)核

上述兩個(gè)批號(hào)鱟試劑（1011181、1102130）經(jīng)由細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品（150601-201174）標(biāo)定，結(jié)果均在 0.5～2.0 λb（標(biāo)準(zhǔn)靈敏度）之間，符合《中國(guó)藥典》的相關(guān)規(guī)定，可用于試驗(yàn)。

2.2 樣品細(xì)菌內(nèi)毒素限值（L）的確定

細(xì)菌內(nèi)毒素限值L=K/M[3]，式中K為成人每千克體重每小時(shí)最大可接受的細(xì)菌內(nèi)毒素劑量，《中國(guó)藥典》規(guī)定注射劑 K=5 EU/（kg·h）；M 為人用每千克體重每小時(shí)的最大供試品劑量，人均體重按60 kg計(jì)算，按照注射用鹽酸胺碘酮說明書的用法與用量，本品成人一日總量1 200 mg，4 h 內(nèi)滴注完畢，L=K/M=5 EU/（kg·h）/1 200 mg×60 kg×4 h=1.0 EU/mg[5]。

2.3 最小有效稀釋濃度（MVC）的確定

限值L為1.000 EU/mg時(shí)，根據(jù)公式MVC＝λ/L，當(dāng)選用鱟試劑靈敏度為λ＝0.125 EU/mL時(shí)，供試品溶液中鹽酸胺碘酮的最大有效稀釋倍數(shù)為MVC=λ/L＝0.125 mg/mL。

2.4 樣品干擾預(yù)實(shí)驗(yàn)

采用靈敏度為0.125 EU/mL的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查鱟試劑，對(duì)批號(hào)為100601的供試品進(jìn)行稀釋檢驗(yàn)，分別稀釋為濃度 0.500、0.250、0.125、0.060 mg/mL。具體過程如下：取本品1瓶（0.15g/瓶）加BET水稀釋至30.0mL（稀釋濃度為5.000mg/mL），取濃度為5.000 mg/mL的稀釋液1.0 mL加BET水至10.0 mL（濃度為0.500 mg/mL），取濃度為0.500 mg/mL的稀釋液5.0 mL加 BET水至 10.0 mL（濃度為 0.250 mg/mL），取濃度為0.250 mg/mL的稀釋液5.0 mL加BET水至10.0 mL（濃度為0.125 mg/mL），取濃度為0.125 mg/mL的稀釋液5.0 mL 加BET 水至 10.0 mL（濃度為 0.060 mg/mL）[6]。試驗(yàn)中另設(shè)陽(yáng)性對(duì)照（PC）和陰性對(duì)照（NC），每個(gè)濃度設(shè)2管平行管，結(jié)果詳見表1。

表1 供試品（批號(hào)100601）干擾預(yù)試驗(yàn)結(jié)果

由表1可以判斷當(dāng)鹽酸胺碘酮濃度為0.500 mg/mL時(shí)，供試品有增強(qiáng)TAL與細(xì)菌內(nèi)毒素之間凝集反應(yīng)的作用，稀釋至濃度0.250 mg/mL時(shí)，干擾現(xiàn)象消除?？梢赃x擇靈敏度λ為0.125 EU/mL的TAL，稀釋樣品至0.125 mg/mL進(jìn)行干擾確證試驗(yàn)。

2.5 供試品干擾試驗(yàn)

取1個(gè)廠家的3批注射用鹽酸胺碘酮，用BET水進(jìn)行稀釋，稀釋濃度為0.125 mg/mL，選用兩個(gè)廠家靈敏度為0.125 EU/mL的鱟試劑進(jìn)行干擾試驗(yàn)，結(jié)果顯示，Et值均落在0.5～2.0 Es范圍內(nèi)，且相應(yīng)的Et/Es比值均在0.5～2.0之間，表明注射用鹽酸胺碘酮稀釋至0.125 mg/mL或者以下濃度時(shí)對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素檢查無干擾作用。見表2。

2.6 供試品細(xì)菌內(nèi)毒素檢查

本品共3批，按《中國(guó)藥典》2010年版二部附錄XI E“細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法”[3]，分別進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查，結(jié)果顯示，供試品注射用鹽酸胺碘酮在稀釋至0.125 mg/mL及以下濃度時(shí)對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素檢查無干擾作用。本研究中將注射用鹽酸胺碘酮的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查限值定為：每1 mg鹽酸胺碘酮中含細(xì)菌內(nèi)毒素的量應(yīng)小于1.0 EU。對(duì)3批樣品分別按擬訂標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行檢驗(yàn)，其細(xì)菌內(nèi)毒素檢查結(jié)果均符合規(guī)定。見表3。

表2 干擾試驗(yàn)結(jié)果

表3 注射用鹽酸胺碘酮細(xì)菌內(nèi)毒素檢查結(jié)果

3 討論

供試品預(yù)干擾試驗(yàn)的目的是評(píng)價(jià)供試品濃度對(duì)鱟試劑與內(nèi)毒素凝集反應(yīng)的干擾程度及干擾性質(zhì)，由試驗(yàn)結(jié)果可得出對(duì)檢查無干擾的樣品濃度范圍及相應(yīng)TAL的靈敏度，減少后續(xù)實(shí)驗(yàn)的盲目性。目前市售的鱟試劑靈敏度（λ）一般在0.50～0.03 EU/mL，因此注射用鹽酸胺碘酮進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)時(shí)不同的鱟試劑所對(duì)應(yīng)的最小有效稀釋濃度 分 別 為 0.500 mg/mL、0.250 mg/mL、0.125 mg/mL、0.060 mg/mL、0.030 mg/mL。由表2可見，當(dāng)鹽酸胺碘酮濃度為0.500 mg/mL時(shí)，供試品有增強(qiáng)TAL與細(xì)菌內(nèi)毒素之間凝集反應(yīng)的作用，稀釋至濃度0.250 mg/mL及以下濃度時(shí)，增強(qiáng)作用消失，干擾現(xiàn)象消除。可確定不出現(xiàn)干擾的第1個(gè)樣品稀釋濃度為注射用鹽酸胺碘酮的0.250 mg/mL稀釋液。因此正式干擾實(shí)驗(yàn)時(shí)，可選擇鱟試劑靈敏度為0.25～0.03EU/mL[7]。

不同廠家的鱟試劑在生產(chǎn)工藝、抗干擾能力等方面存在差異。因此，本研究采用兩個(gè)不同廠家的、靈敏度0.125EU/mL的鱟試劑，對(duì)3個(gè)批號(hào)樣品進(jìn)行正式干擾實(shí)驗(yàn)，其Et/Es均在0.5～2.0范圍內(nèi)，說明樣品在該濃度下對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法（凝膠法）無干擾。因此，可將注射用鹽酸胺碘酮的細(xì)菌內(nèi)毒素限值L定為1.0 EU/mg，選擇靈敏度λ為0.25～0.03 EU/mLTAL，并將樣品稀釋到相應(yīng)濃度檢查細(xì)菌內(nèi)毒素限度[8]。

試驗(yàn)表明，本品可按《中國(guó)藥典》2010年版二部附錄ⅪE第一法（凝膠法）檢查細(xì)菌內(nèi)毒素，限值設(shè)為：每1毫克鹽酸胺碘酮中含細(xì)菌內(nèi)毒素的量應(yīng)小于1.0 EU。經(jīng)檢驗(yàn)，3批樣品內(nèi)毒素檢查均符合規(guī)定。

國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn) （WS1-（X-211）-2004Z）中僅規(guī)定了注射用鹽酸胺碘酮熱原檢查的劑量為：加滅菌注射用水配制成每1毫升約含鹽酸胺碘酮30 mg的溶液，按家兔體重每千克注射1 mL，應(yīng)符合規(guī)定?！吨袊?guó)藥典》2010年版、美國(guó)藥典、日本藥典、歐洲藥典7.0版、英國(guó)藥典2010年版均未對(duì)注射用鹽酸胺碘酮細(xì)菌內(nèi)毒素限值作出規(guī)定[9]。但由于本次試驗(yàn)只收集到1個(gè)廠家樣品進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查的方法學(xué)研究實(shí)驗(yàn)，樣品批次較少，建議進(jìn)一步收集多廠家多批次樣品進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查的方法學(xué)研究實(shí)驗(yàn)，如按上述實(shí)驗(yàn)進(jìn)行，結(jié)果符合細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法學(xué)的要求，可按本研究中擬定注射用鹽酸胺碘酮細(xì)菌內(nèi)毒素檢查標(biāo)準(zhǔn)對(duì)其質(zhì)量進(jìn)行控制。

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