ALDH1+、CD44+/CD24-重疊與乳腺癌基因亞型和臨床因素的相關(guān)性研究

曾妮，韓明利，屈洪波，朱志坤，蔡建英，陳力學(xué)，吳誠義

（重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院1.內(nèi)分泌外科；2.重慶市神經(jīng)病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400016）

ALDH1+或CD44+/CD24-表達(dá)是目前公認(rèn)的檢測(cè)分析乳腺癌干細(xì)胞較為廣泛的標(biāo)志物，在細(xì)胞成瘤實(shí)驗(yàn)中，ALDH1+CD44+CD24-已被證實(shí)成瘤能力和轉(zhuǎn)移能力最強(qiáng)［1］，而鮮見人類乳腺組織同例標(biāo)本中重疊表達(dá)此兩種干細(xì)胞標(biāo)志物的情況研究。本實(shí)驗(yàn)使用免疫組化單染和雙染技術(shù)聯(lián)合檢測(cè)我院203例乳癌患者標(biāo)本中ALDH1和CD44/CD24表達(dá)情況，探討分析它們?cè)诨騺喰椭械姆植技芭c臨床各因素的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

收集重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院2006年9月至2011年9月行乳腺癌改良根治術(shù)和B超引導(dǎo)下核心穿刺活檢術(shù)患者的手術(shù)標(biāo)本，術(shù)前均未接受放化療、內(nèi)分泌治療、靶向治療，術(shù)后石蠟病理報(bào)告均證實(shí)為乳腺癌，除外Ⅳ期乳腺癌、資料不完整或失訪患者，納入本次研究的乳癌患者共有203例，均為女性，其病理類型包括浸潤性導(dǎo)管癌140例，浸潤性小葉癌22例，髓樣癌9例，黏液腺癌14例，其他類型癌18例。術(shù)后根據(jù)臨床分期、ER、PR、Cerb-B2情況選擇或聯(lián)合放化療、內(nèi)分泌治療、靶向治療等?；颊唠S訪3～28個(gè)月，中位隨訪時(shí)間為12個(gè)月，隨訪方式主要為電話訪問、門診復(fù)查和本院病案科歷史病歷查詢。

1.2 試劑與方法

1.2.1 試劑：ALDH1兔抗人多克隆抗體購于英國Abcam公司；CD24兔抗人單克隆抗體購于中國北京博奧森生物技術(shù)有限公司；CD44鼠抗人單克隆抗體、Polymer雙染檢測(cè)試劑盒、SP免疫組化染色試劑盒、二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色試劑盒均購于中國北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)方法：收集標(biāo)本石蠟包埋，4 μm厚連續(xù)切片4張，1張行HE染色，另2張行免疫組化染色，1張備用。（1）免疫組化單染ALDH1：常規(guī)脫蠟水化，3%H2O237℃浸泡15 min，枸櫞酸鹽緩沖液微波熱修復(fù)30 min，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌5 min 3次，3%正常羊血清培育25 min，加一抗（ALDH1兔抗人抗體工作液濃度1∶100）4℃過夜，復(fù)溫1 h，PBS洗滌30 min，加入二抗37℃30 min，PBS洗滌30 min，顯微鏡下控制DAB顯色，清水終止顯色，蘇木素染色4 min，鹽酸酒精2 s，碳酸鋰1 min，二甲苯20 min，乙醇梯度脫水，中性樹膠封片。PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。（2）免疫組化雙染檢測(cè)CD44+/CD24-的表達(dá)：CD44和CD24抗體的工作液濃度分別為1∶50和1∶100。實(shí)驗(yàn)步驟按雙染試劑盒說明書進(jìn)行，DAB和AP-Red顯色，蘇木素復(fù)染，用CD44和CD24單染免疫組化做對(duì)照。

1.2.3 結(jié)果判定：

1.2.3.1 免疫組化單染結(jié)果判定 ALDHl陽性細(xì)胞為細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜棕黃色。根據(jù)顯色細(xì)胞比例為染色結(jié)果評(píng)分。按陽性染色細(xì)胞比例評(píng)分：0～10%為陰性0分；10%～25%為陽性1+；25%～50%為陽性2+；超過 50%為陽性 3+［2］。

1.2.3.2 免疫組化雙染結(jié)果判定 CD44陽性細(xì)胞為細(xì)胞膜棕黃色，CD24陽性細(xì)胞為細(xì)胞質(zhì)紅色，呈棕黃色無紅色的細(xì)胞鑒定為CD44+/CD24-，結(jié)果判讀參照Honeth等［3］的評(píng)分方法：無陽性細(xì)胞為0分；陽性細(xì)胞1%～<10%為1分；陽性細(xì)胞10%～<5 0%為2分；陽性細(xì)胞50%～<75%為3分；陽性細(xì)胞75%～100%為4分。0分為陰性，≥1分為陽性。

1.2.3.3 HER-2結(jié)果判定 根據(jù)重慶醫(yī)科大學(xué)病理診斷中心報(bào)告，HER-2免疫組化染色不表達(dá)或“+”被判定為陰性，“++”或更高表達(dá)加用熒光原位雜交（fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH） 進(jìn)行驗(yàn)證，F(xiàn)ISH擴(kuò)增為陽性，相反則為陰性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 17．0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)或Fisher精確概率檢驗(yàn)，生存分析采用Kaplan Meier法、log-rank檢驗(yàn)比較生存差異，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ALDH1、CD44/CD24在乳腺癌基因亞型中的分布

ALDH1表達(dá)位于細(xì)胞質(zhì)和（或）細(xì)胞膜，呈棕黃色；CD44表達(dá)位于細(xì)胞膜，呈棕黃色；CD24表達(dá)位于細(xì)胞質(zhì)，陽性表達(dá)呈紅色，棕黃色無紅色為不表達(dá)，見圖1。

2011年第12屆國際乳腺癌會(huì)議將ER、PR、HER-2、Ki67表達(dá)情況制訂5種新的乳腺癌基因亞型［4］，本實(shí)驗(yàn)根據(jù)重慶醫(yī)科大學(xué)病理診斷中心報(bào)告，203例乳腺癌中：Luminal A型39例 （19%）；Luminal B （HER-2-）型90例（44%）；Luminal B（HER-2+）型 21例（10%）；HER-2型 22例（11%）；Triple negative型31例（15%）。ALDH1陽性表達(dá)為20例（10%），主要在HER-2型（20%）和Triple negative型（40%）高表達(dá)，ALDH1陽性在乳腺癌各分子亞型中的表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.006）。CD44+/CD24-表型為 84例（41%），Triple negative型乳腺癌組織中含CD44+/CD24-表型為24例（77%），明顯高于其他分子亞型，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000）。ALDH1+/CD44+/CD24-/low型為11例（5%），主要分布在HER-2型（18%）和Triple negative型（45%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000），見表1。

表1 ALDH1、CD44/CD24及聯(lián)合ALDH1、CD44/CD24在乳腺癌各分子亞型中表達(dá)的比較（例）Tab.1 The distribution of ALDH1+，CD44+/CD24-and the combination of ALDH1 and CD44/CD24 in breast cancer molecular subtypes（case）

2.2 ALDH1、CD44/CD24與乳腺癌患者臨床病理特征的相關(guān)性

結(jié)果顯示，ALDH1+表達(dá)與乳腺癌患者的年齡、腫瘤大小、淋巴結(jié)狀態(tài)、病理類型、ER，PR等臨床相關(guān)變量分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），而與臨床分期有關(guān)（P<0.05）；CD44+/CD24-、ALDH1+/CD44+/CD24-表型與乳腺癌患者的年齡、腫瘤大小、臨床分期、淋巴結(jié)狀態(tài)、ER，PR等臨床相關(guān)因素?zé)o明顯相關(guān)性（P>0.05），而與病理類型有關(guān)（P<0.05），見表2。

2.3 ALDH1、CD44/CD24與乳腺癌患者2年無病生

存率關(guān)系及復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移情況

ALDH1+患者2年無病生存率為55%，ALDH1-患者2年無病生存率為82%；CD44+/CD24-表型患者2年無病生存率為76%，非CD44+/CD24-表型患者2年無病生存率為83%；ALDH1+/CD44+/CD24-表型患者2年無病生存率為36%，明顯低于其他類型，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見圖2。

3 討論

表2 ALDH1、CD44/CD24與乳腺癌患者臨床病理特征的關(guān)系Tab.2 Relationship between ALDH1，CD44/CD24 expressions and clinicopathological characteristics in patients with breast cancer

目前腫瘤干細(xì)胞的分選及標(biāo)志物的準(zhǔn)確選擇成為“腫瘤干細(xì)胞學(xué)說”的瓶頸，乳腺癌干細(xì)胞標(biāo)志物的選擇主要集中在 ALDH1+、CD44+/CD24-之間［5］。CD44+/CD24-作為干細(xì)胞標(biāo)志物具有組織特異性，即其只是乳腺癌干細(xì)胞標(biāo)志物［6］。在本組實(shí)驗(yàn)中，表達(dá)CD44+/CD24-表型乳腺癌有84例（41%），主要存在于Triple negative型，很多研究認(rèn)為CD44+/CD24-表型與 basal-like 型乳腺癌密切相關(guān)［2，7］，Sheridan等［8］分析了13種乳腺癌細(xì)胞株，發(fā)現(xiàn)表達(dá)CD44+/CD24-表型的所有細(xì)胞系存在于基底的/間充質(zhì)的/肌上皮的亞型細(xì)胞系中，表達(dá)CD44+/CD24-表型的乳癌細(xì)胞只表達(dá)基底/間葉/肌上皮細(xì)胞標(biāo)志，缺乏管腔上皮細(xì)胞標(biāo)志表達(dá)，他們認(rèn)為表達(dá)CD44+/CD24-表型的乳腺癌細(xì)胞也許起源于基底的/肌上皮的細(xì)胞，并且CD44+/CD24-表型乳腺癌細(xì)胞高表達(dá)侵襲性基因，患者預(yù)后差。還有研究提示basal-like型乳腺癌可通過誘發(fā)EMT使非CD44+/CD24-表型乳腺癌細(xì)胞表達(dá)CD44+/CD24-表型［9］，這也許是basal-like型乳腺癌高表達(dá)CD44+/CD24-表型的原因之一。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示CD44+/CD24-表型與患者年齡、腫瘤大小、臨床分期、淋巴結(jié)狀態(tài)、ER，PR等臨床相關(guān)因素?zé)o明顯相關(guān)性，但與病理類型有關(guān)，主要存在于浸潤性導(dǎo)管癌，CD44+/CD24-表型患者2年無病生存率較非CD44+/CD24-表型差，這與以往報(bào)道結(jié)果基本一致［10］。

ALDH1是一種氧化還原酶，參與細(xì)胞內(nèi)的醛氧化過程［5］，它作為腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物沒有組織特異性。在本組實(shí)驗(yàn)中，ALDH1+表達(dá)為20例（10%），符合干細(xì)胞只占腫瘤細(xì)胞極少比例的特性。主要在HER-2型（20%）和Triple negative型（40%）高表達(dá)，研究顯示［11］ALDH1+與 BRCA1 因子密切相關(guān)，ALDH1+/ER-型乳腺干/祖細(xì)胞可通過BRCA1的作用分化為ALDH1-/ER+上皮細(xì)胞，BRCA1一旦缺失，將導(dǎo)致ALDH1+/ER-型乳腺干/祖細(xì)胞的遺傳不穩(wěn)定積累，最終導(dǎo)致管腔分化紊亂或管腔細(xì)胞凋亡進(jìn)而發(fā)展成為乳腺癌。部分研究認(rèn)為ALDH1+表達(dá)與HER-2過表達(dá)正相關(guān)，且ALDH1與HER-2是導(dǎo)致患者預(yù)后不良的危險(xiǎn)因素［12］，也有研究結(jié)果提示ALDH1與HER-2不相關(guān)，HER-2過表達(dá)與組織學(xué)分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)［13］，這也許能提示腫瘤來源不同［14，15］或代表不同的遺傳變異［15］。ALDH1+與 CD44+/CD24-也許是通過不同層次來區(qū)別標(biāo)志不同層次的乳腺癌干細(xì)胞［14］，這也可能暗示著不同的癌干細(xì)胞標(biāo)志物指向不同的乳腺癌干細(xì)胞類型。ALDH1+與CD44+/CD24-單獨(dú)表達(dá)時(shí)，多數(shù)研究認(rèn)為與患者臨床相關(guān)因素?zé)o明顯相關(guān)性，本組實(shí)驗(yàn)將兩種標(biāo)志物結(jié)合分析，得出重疊表達(dá)這兩種標(biāo)志物的乳腺癌患者2年無病生存率明顯低于其他，這也許是結(jié)合兩種標(biāo)志物純化了“癌干細(xì)胞群”，同時(shí)也可能代表了不同來源的癌干細(xì)胞，提示未來聯(lián)合癌干細(xì)胞標(biāo)志物也許能預(yù)測(cè)患者預(yù)后。

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