白介素18基因啟動子區(qū)－137G/C單核苷酸多態(tài)性與顱內(nèi)動脈瘤發(fā)病和破裂的關(guān)系研究

陳 廣，李云超，邱 虹，于向東，邵德明

顱內(nèi)動脈瘤 (IAs)是一種致死率高、致殘率高的腦血管疾病，病因和發(fā)病機(jī)制至今尚未完全明了。本研究旨在通過病例－對照研究的方法，運(yùn)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)－限制性片段長度多態(tài)性 (PCR－RFLP)及DNA直接測序檢測我院和唐山市工人醫(yī)院收治的195例IAs患者的白介素 (IL) －18基因啟動子區(qū)－137G/C單核苷酸多態(tài)性 (SNP)位點(diǎn)的基因型頻率和等位基因頻率，探索IL－18基因多態(tài)性與IAs發(fā)病、破裂的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2008年3月—2009年10月在河北聯(lián)合大學(xué)附屬開灤總醫(yī)院和唐山市工人醫(yī)院神經(jīng)外科住院治療的IAs患者98例 (動脈瘤組)，均為唐山地區(qū)漢族人;其中男47例，女51例;年齡30～70歲;均通過全腦血管造影 (雙側(cè)椎動脈、雙側(cè)頸內(nèi)動脈、雙側(cè)頸外動脈)確診為顱內(nèi)囊性動脈瘤;均無IAs及蛛網(wǎng)膜下腔出血 (SAH)家族史，并且排除常染色體顯性遺傳性多囊腎病 (ADPKD)、Ehlers－Danlos綜合征Ⅳ型和馬凡綜合征。將動脈瘤組進(jìn)一步分為破裂組62例和未破裂組36例;破裂引起的SAH經(jīng)顱腦CT或腰椎穿刺證實(shí)，破裂組均為初發(fā)SAH。因自發(fā)性SAH入院，但經(jīng)數(shù)字減影血管造影 (DSA)檢查未發(fā)現(xiàn)IAs的患者，或確診為腦血管畸形、動靜脈瘺、煙霧病患者，未列入本研究。另選取同期住院治療的非腦血管疾病患者97例 (對照組)，其中男53例，女44例;年齡33～72歲;均經(jīng)顱腦MRA、螺旋CT血管成像(CTA)或DSA檢查排除IAs。動脈瘤組和對照組均無卒中病史、無IAs及SAH家族史、無遺傳性結(jié)締組織病史，病例彼此間無親緣關(guān)系。動脈瘤組與對照組患者的性別、年齡、既往史 (高血壓史、糖尿病史、冠心病史)、個(gè)人史 (吸煙史、飲酒史)比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＞0.05，見表1)，兩組患者基線標(biāo)準(zhǔn)齊平，具有可比性。

表1 兩組臨床資料比較Table 1 Comparison of clinical information between two groups

1.2 方法 提取195例患者的外周血基因組 DNA，采用 PCR－RFLP及DNA直接測序的方法檢測IL－18基因啟動子區(qū)－137G/C SNP位點(diǎn)的基因型頻率和等位基因頻率。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 資料錄入采用Excel軟件建立數(shù)據(jù)庫，并進(jìn)行雙遍錄入及核查，應(yīng)用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料以 (±s)表示，組間比較采用成組t檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 IL－18基因啟動子區(qū)－137G/C SNP與IAs的關(guān)系 標(biāo)本均成功擴(kuò)增出目的片段。在瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)中均能觀察到對應(yīng)于相應(yīng)標(biāo)記物標(biāo)記位置的片段。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為259 bp片段 (見圖1)。

圖1 IL－18基因啟動子區(qū)－137G/C電泳的PCR產(chǎn)物Figure 1 PCR products of electrophoresis of the IL－18 gene－137G/C

2.2 動脈瘤組和對照組IL－18基因啟動子區(qū)－137G/C SNP位點(diǎn)的測序結(jié)果 經(jīng)DNA直接測序發(fā)現(xiàn)3種基因型:野生型純合子GG，雜合子GC，突變型純合子CC。測序結(jié)果見圖2。

圖2 IL－18基因啟動子區(qū)－137G/C SNP位點(diǎn)的測序結(jié)果Figure 2 Sequencing result of genotypes in IL－18－137G/C SNP

2.3 動脈癌組和對照組IL－18基因啟動子區(qū)－137G/C SNP位點(diǎn)多態(tài)性分布 動脈瘤組IL－18基因啟動子區(qū)－137G/C SNP位點(diǎn)基因型及等位基因分布與對照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05)，其中基因型以GG型最多，其次為GC和CC型，等位基因以G多見;動脈瘤組G等位基因的頻率與對照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05，見表2)。

表2 動脈瘤組與對照組IL－18基因啟動子區(qū)－137G/C SNP位點(diǎn)的多態(tài)性分布〔n(%)〕Table 2 Polymorphism distribution of IL－18－137G/C SNP in IAs patients and controls

2.4 IAs患者破裂組與未破裂組 IL－18基因啟動子區(qū)－137G/C SNP位點(diǎn)多態(tài)性分布 破裂組IL－18基因啟動子區(qū)－137G/C SNP位點(diǎn)基因型及等位基因分布與未破裂組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05)，其中基因型以GG型多見，其次為CC和GC型，等位基因以G型多見;破裂組G等位基因的頻率與未破裂組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05，見表3)。

表3 IAs患者破裂組與未破裂組IL－18基因啟動子區(qū)－137G/C SNP位點(diǎn)的多態(tài)性分布〔n(%)〕Table 3 Polymorphism distribution of IL－18－137G/C SNP in ruptured and non－ruptured IAs patients

3 討論

IAs的相關(guān)致病基因逐漸被人們所重視，并進(jìn)行了深入研究，不少學(xué)者認(rèn)為IAs是一種由多種環(huán)境因素和多個(gè)基因共同作用的多基因疾?。?－2］。分子生物學(xué)研究表明，IL－18基因存在基因變異及多態(tài)性，其多態(tài)性可影響IL－18轉(zhuǎn)錄和翻譯，進(jìn)而影響IL－18相關(guān)的炎性疾病的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸［3］。目前對IL－18基因多態(tài)性的研究主要是針對過敏性疾病、病毒感染、自身免疫性疾病、腫瘤及損傷后膿毒癥等疾病，研究表明IL－18與這些疾病的發(fā)生有一定關(guān)系。少數(shù)研究對IL－18基因多態(tài)性與心血管疾病的關(guān)系進(jìn)行了研究。周超等［4］報(bào)道IL－18基因啟動子區(qū)－137位點(diǎn)多態(tài)性與兒童結(jié)核病易患性有關(guān)，－137位點(diǎn)等位基因G可影響IL－18蛋白表達(dá)，可能是結(jié)核病的易患基因。Imboden等［5］報(bào)道IL－18基因啟動子區(qū)－137位點(diǎn)等位基因G是過敏性哮喘的遺傳危險(xiǎn)因素。

越來越多的證據(jù)表明，IL－18基因多態(tài)性誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)在IAs的發(fā)生、發(fā)展和破裂的過程中扮演著重要角色。IL－18基因多態(tài)性通過誘導(dǎo)炎性反應(yīng)可以引起白細(xì)胞黏附于血管壁，淋巴細(xì)胞免疫應(yīng)答，炎性細(xì)胞因子〔IL、腫瘤壞死因子(TNF)等〕、基質(zhì)金屬蛋白酶 (MMP)和其他蛋白溶解酶釋放，引起血管壁的血管內(nèi)皮損傷、膠原蛋白減少、細(xì)胞外基質(zhì)降解和重構(gòu)，并導(dǎo)致血管壁的脆性增加，繼而與其他因素一起導(dǎo)致動脈瘤的發(fā)生。Chyatte等［6］為了明確炎癥或免疫反應(yīng)與IAs的關(guān)系，在顯微外科手術(shù)中收集了25例患者的動脈瘤組織 (前交通動脈瘤10例、大腦中動脈瘤9例、頸內(nèi)動脈瘤5例、基底動脈瘤1例)，其中23例未破裂，2例已破裂，動脈瘤直徑 (9.2±4.9)mm;另外從死亡24 h內(nèi)的尸檢中收集11例基底動脈組織作為對照，兩組間無年齡、性別差異。采用免疫組織化學(xué)法對動脈瘤組織研究 (因?yàn)椴糠謽?biāo)本體積太小而無法染色，各組的標(biāo)本數(shù)不同)發(fā)現(xiàn)，巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞(CD68)在近一半 (10/22)的動脈瘤全層陽性，其中6例為彌漫性、4例為局限性浸潤，T淋巴細(xì)胞 (CD3)近一半 (6/13)為陽性，而以上細(xì)胞在對照組全部 (11例)為陰性;B淋巴細(xì)胞 (CD20)在一小部分 (3/19)中為陽性，而對照組也均為陰性;所有動脈瘤標(biāo)本 (19/19)瘤壁全層補(bǔ)體C3c均為陽性，其中9/19的標(biāo)本呈彌漫性陽性，而在對照組僅3/11在管腔一側(cè)為小片狀陽性;補(bǔ)體C9在絕大部分動脈瘤中(18/19)全層陽性，其中15/19為彌漫性陽性，而對照組3/9為彌漫性陽性，3/9為小片狀陽性且位于管腔側(cè);半數(shù)以上的(12/17)免疫球蛋白IgG陽性，其中5/17為彌漫性陽性，而對照組中僅1/9為彌漫性陽性;IgM也有類似的表現(xiàn);血管細(xì)胞黏附分子－1在大多數(shù)動脈瘤全層中 (11/14)為陽性，且除1例為局部陽性外，其他均為彌漫性陽性，而在對照組5/7僅在內(nèi)膜和外膜為陽性，卻無一例全層陽性。以上各種成分可同時(shí)存在，但并非絕對。以上發(fā)現(xiàn)提示動脈瘤壁存在炎癥反應(yīng)或免疫反應(yīng)。另外，Kataoka等［7］研究發(fā)現(xiàn)在破裂和未破裂的IAs局部均有大量的巨噬細(xì)胞和白細(xì)胞侵潤，不僅在破裂的動脈瘤局部存在一定的炎癥反應(yīng)和免疫反應(yīng)，而且在未破裂的動脈瘤局部及周圍同樣存在一定的炎癥反應(yīng)和免疫反應(yīng)，提示炎癥反應(yīng)并非動脈瘤破裂所繼發(fā)，而是貫穿于IAs的發(fā)生、發(fā)展和破裂的全過程。

目前國內(nèi)外對炎性基因SNP與動脈瘤關(guān)系的研究已成為熱點(diǎn)，目前已有報(bào)道的基因包括:IL－1β基因、IL－6基因、TNF－α基因等。Morgan等［8］研究發(fā)現(xiàn)，IL－6基因啟動子區(qū)－174G＞C和－572G＞C多態(tài)性與動脈瘤發(fā)生相關(guān)，并對91例高加索動脈瘤患者進(jìn)行了基因型的測定，與正常人對照后發(fā)現(xiàn)，兩組之間在等位基因頻率和基因型上存在顯著差別。動脈瘤組中－572位點(diǎn)上出現(xiàn)C等位基因的頻率以及出現(xiàn)C純合子基因型的頻率顯著高于對照組;而在－174位點(diǎn)上，對照組出現(xiàn)C純合子基因型的頻率顯著高于動脈瘤組。Yamada等［9］在日本人群中證實(shí)，TNF基因啟動子－863位點(diǎn)等位基因A和基因型AA與動脈瘤相關(guān)。動脈瘤患者中G等位基因和GG基因型頻率均顯著高于正常對照人群。我們認(rèn)為，雖然不同種族的動脈瘤患者優(yōu)勢等位基因不同，但這些優(yōu)勢等位基因必然通過相同的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑導(dǎo)致動脈瘤的發(fā)生。

本研究結(jié)果顯示，對照組IL－18基因啟動子區(qū)－137G/C SNP位點(diǎn)G、C等位基因頻率分別為80.4%、19.6%，與國內(nèi)其他報(bào)道中 IL－18基因啟動子區(qū) －137G/C SNP位點(diǎn) G(82%)、C(18%)等位基因頻率相一致。IL－18基因啟動子區(qū)－137G/C SNP位點(diǎn)各基因型和等位基因頻率在動脈瘤組與對照組之間、破裂組與未破裂組之間均有差異，說明IL－18基因啟動子區(qū)－137G/C SNP位點(diǎn)可能在IAs的發(fā)病和破裂過程中起主要作用。與對照組比較，IAs患者IL－18基因啟動子區(qū)－137G/C SNP位點(diǎn)G等位基因頻率和GG基因型頻率高，而破裂組與未破裂組比較，IL－18基因啟動子區(qū)－137G/C SNP位點(diǎn)G等位基因頻率和GG基因型頻率更高。說明IL－18基因啟動子區(qū)－137G/C SNP位點(diǎn)G等位基因可能通過如下機(jī)制促進(jìn)IL－18的轉(zhuǎn)錄和翻譯: －137G/C SNP位點(diǎn)位于IL－18基因轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游的啟動子區(qū)，由G變?yōu)镃改變核因子H4TF－1的結(jié)合位點(diǎn)，并由此阻斷受H4TF－1調(diào)控的基因轉(zhuǎn)錄，使IL－18表達(dá)水平增加，并誘導(dǎo)γ干擾素 (IFN－γ)的生成和激活，IL－18通過核因子κB途徑促進(jìn)炎性遞質(zhì)及黏附分子基因的轉(zhuǎn)錄合成，它還可以誘導(dǎo)趨化因子和其他多種細(xì)胞因子的表達(dá)，從而發(fā)揮致炎效應(yīng)。

綜上所述，由于破裂動脈瘤的預(yù)后不良，故對于未破裂的動脈瘤而言，發(fā)現(xiàn)動脈瘤壁廣泛存在的炎癥反應(yīng)和免疫反應(yīng)有著重要的臨床價(jià)值。所以基因多態(tài)性與動脈瘤壁炎癥反應(yīng)和免疫反應(yīng)研究尤為重要。隨著對炎癥和動脈瘤關(guān)系的進(jìn)一步了解，基因多態(tài)性的特異性抗炎治療將有助于防止IAs的發(fā)生和破裂。

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