響應面法優(yōu)化超聲波輔助提取苦杏仁渣中杏仁蛋白工藝

殷振雄，張 繼，*，趙保堂，宋 珅，藺彥斌，張 繼

(1.西北師范大學生命科學學院，甘肅蘭州730070;2.西北師范大學化學化工學院，甘肅蘭州730070)

杏仁，薔薇科植物山杏(Prunus armeniaca L var ansu Maxim)、西伯利亞杏(Prunussibirica L)、東北杏(Prunus mandshurica Maxim)或杏(Prunus armeniaca L)的干燥成熟種子［1］?！侗静菥V目》記載，杏仁有“潤肺脾、消食積、散滯氣”三大好處，其本身含有豐富的蛋白質，既是高級營養(yǎng)品，又可供藥用［2］。杏仁含蛋白質22.5%、脂肪44.8%、糖23.9%、膳食纖維8.0%。杏仁含有豐富礦物質，每100g杏仁中含鈣234mg、磷504mg、鎂 260mg、鉀 773mg、鐵 4.7mg、鋅 3.11mg，維生素B1、維生素B2、維生素E和胡蘿卜素，杏仁中特有的苦杏仁苷達3%［3］。杏仁蛋白的氨基酸比例平衡，最優(yōu)氨基酸組合和其他植物蛋白的質量相當，是一種良好的植物蛋白資源［4］。目前蛋白質提取大多利用稀鹽和緩沖系統(tǒng)的水溶液提取法，對于不溶于水、稀鹽溶液、稀酸或稀堿中，可用乙醇、丙酮和丁醇等的有機溶劑提取法等。甘肅省平涼、慶陽地處隴東黃土高原溝壑區(qū)，自然條件非常適合杏樹生長，杏產量占全省70%左右［4］。本研究利用超聲波輔助提取法［5－7］，以甘肅產苦杏仁渣為原料，以杏仁蛋白提取率為指標，通過單因素和響應面實驗［8－12］，研究超聲波輔助條件下堿提酸沉法的不同因素變化對杏仁蛋白提取率的影響，優(yōu)化了杏仁蛋白的提取工藝，并與大豆蛋白、小麥蛋白進行了性能比較，以期為進一步研究其理化功能等奠定一定的基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

苦杏仁 產于甘肅省平涼市，提取杏仁油后的苦杏仁渣粉碎后過40目篩;考馬斯亮藍G250 北京西美杰科技有限公司，分析純;檸檬酸、NaOH、硫酸銅、硫酸鉀、硫酸、硼酸、甲基紅、溴甲酚綠 天津市福晨化學試劑廠，分析純;牛血清白蛋白 純度98%，分析純，Bio Basic公司。

JJ－1精密定時電動攪拌器 金壇市榮華儀器制造有限公司;KQ－250B型超聲波發(fā)生器 昆山市超聲儀器有限公司;pHS－25數(shù)顯pH計 上海精密科學儀器有限公司;紫外可見分光光度計 北京萊伯泰科儀器有限公司;LJG－18S冷凍干燥機 北京泰華儀器有限責任公司;TBL5M臺式超大容量冷凍離心機 湘儀離心機廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 杏仁蛋白的提取流程 見圖1。

圖1 杏仁蛋白的提取流程Fig.1 The flow diagram of extraction

1.2.2 超聲輔助提取杏仁蛋白的單因素實驗

1.2.2.1 超聲時間對杏仁蛋白提取率的影響 準確稱量2.0g樣品，在料液比 1∶20，pH 9.5，溫度 45℃下用超聲波并攪拌浸提 0.5、1、1.5、2、2.5h，然后以4000r/min離心20min。去掉油層和沉淀，取清液2.5mL稀釋20倍，利用考馬斯亮藍G－250染色法在595nm波長下比色。以蛋白質的提取率為指標，繪制時間與提取率的關系曲線。

1.2.2.2 pH對杏仁蛋白提取率的影響 準確稱量2.0g已粉碎樣品，在溫度45℃，料液比1∶20，pH 為8、9、10、11、12 的條件下超聲波并攪拌提取 1.5h，其余同1.2.2.1。

1.2.2.3 料液比對杏仁蛋白提取率的影響 準確稱量2.0g已粉碎樣品，在溫度45℃，pH9.5，料液比為1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35 的條件下超聲波并攪拌下浸提1.5h，其余同1.2.2.1。

1.2.2.4 溫度對杏仁蛋白提取率的影響 準確稱量2.0g已粉碎樣品，在pH9.5，料液比為1∶20，溫度分別為 35、40、45、50、55℃ 的條件下超聲波并攪拌提取1.5h，其余同 1.2.2.1。

1.2.3 Box－Behnken實驗設計 采用Design－Expert 7.0軟件，應用Box－Behnken設計杏仁蛋白提取率為響應值對主要影響因素進行優(yōu)化，從中篩選提取杏仁蛋白提取率的最優(yōu)提取條件。根據(jù)Box－Benhnken的中心組合實驗設計原理，選定提取時間、pH、提取溫度3個對超聲提取影響的因素進行單因素實驗。在單因素的基礎上，確定響應面實驗的因素和水平(見表1)。

表1 Box－Behnken實驗設計因素水平Table 1 Levels of factors of Box－Behnken design

1.2.4 杏仁渣中蛋白質含量的測定 采用凱氏定氮法測定并計算杏仁渣中總蛋白的含量(ω)。通過考馬斯亮藍G250染色法測定提取液中蛋白質含量(ρ)，并按下列公式計算蛋白提取率(Y)。

式中，Y－蛋白提取率(%);ρ－提取液蛋白質量濃度(g/mL);V－提取液體積(mL);ω－杏仁渣中總蛋白含量(%);m－杏仁渣質量(g)。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理方法 運用Design－Excerpt軟件對響應值進行回歸分析、方差分析，用F檢驗判定回歸方程中各變量對響應值影響的顯著性。

2 結果與討論

2.1 粗蛋白的測定

經凱氏定氮法測定，杏仁渣中粗蛋白的含量為45.5%。

2.2 單因素實驗

2.2.1 提取時間對杏仁渣中蛋白提取率的影響 在料液比1∶20，pH 9.5，溫度45℃下，不同提取時間對杏仁渣中蛋白提取率的影響如圖2所示。

圖2 提取時間對蛋白提取率的影響Fig.2 The influence of time to the extraction yield

由圖2可知，杏仁蛋白提取率隨時間的增加而增加，當處理時間大于1.5h時，杏仁蛋白的提取率開始下降，所以初步確定杏仁渣超聲波提取1.5h。

2.2.2 pH對杏仁渣中蛋白提取率的影響 在料液比1∶20，提取時間1.5h，溫度45℃下，不同pH對杏仁渣中蛋白提取率的影響如圖3所示。

圖3 提取pH對蛋白提取率的影響Fig.3 The influence of pH to the extraction yield

由圖3可知，pH對蛋白質的提取率有明顯的影響，當提取液pH8～10時，杏仁蛋白質提取率逐漸增加;當pH超過10以后，杏仁蛋白的提取率隨pH的增大而減小，因此確定提取液的pH為10。

2.2.3 料液比對杏仁渣中蛋白提取率的影響 在提取時間1.5h，pH 9.5，溫度45℃下，不同料液比對杏仁渣中蛋白提取率的影響如圖4所示。

由圖4可知，隨料液比的增大，蛋白質的提取率也在增大，在料液比大于1∶30后，蛋白質提取率提高變得緩慢。在實驗范圍內雖然料液比為1∶35時的蛋白質提取率最大為76.8%，而料液比為1∶30時，蛋白質的提取率也達到了75.6%，但是太高的料液比不利于后續(xù)處理，故選取料液比為1∶30。

表3 方差分析Table 3 Variance analysis

圖4 料液比對蛋白提取率的影響Fig.4 The influence of material to water ratio to the extraction yield

2.2.4 提取溫度對杏仁渣中蛋白提取率的影響 在提取時間1.5h，pH 9.5，料液比1∶30下，不同提取溫度對杏仁渣中蛋白提取率的影響如圖5所示。

圖5 提取溫度對蛋白提取率的影響Fig.5 The influence of temperature to the extraction yield

由圖5可知，隨著溫度的增大，杏仁蛋白的提取率呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢，這是由于在溫度過低時，蛋白質在水中的溶解性不高，但是溫度過高時，極易造成蛋白質變性，變性后的蛋白質易沉淀，經過離心，作為沉淀棄除，因此，當杏仁蛋白的提取溫度高于45℃時，杏仁蛋白極易變性，導致提取率變低，故確定杏仁蛋白的提取溫度為45℃。

2.3 提取條件優(yōu)化

通過單因素實驗，選擇合理的因素水平進行響應面實驗，以確定最佳的提取條件。杏仁蛋白提取的Box－Benhnken實驗結果見表2。

表2 Box－Behnken實驗設計結果Table 2 Results of data analysis by Box－Behnken design

2.4 響應面分析

以X1(時間)、X2(pH)、X3(溫度)為自變量，杏仁蛋白的提取率Y為響應值，所得二次回歸方程為:

運用Design－Excerpt軟件對17個實驗點的響應值進行回歸分析，方差分析結果如表3所示，用F檢驗判定回歸方程中各變量對響應值影響的顯著性，概率越小，則相應變量的顯著程度越高。

由表4可以看出，模型的決定系數(shù)(R2=0.9047)，變異系數(shù)C.V=4.34%，表明多項式模型的精確性、有效性是合理的。

表4 杏仁蛋白提取率二次項模型的適合度分析Table 4 Analysis the fitness of quadratic polynomial model for extraction yield

2.5 各因素交互作用分析

為了進一步考察3個實驗因子:超聲提取時間(X1)、pH(X2)及提取溫度(X3)的交互作用以及確定最優(yōu)點，對回歸模型采用降維法分析，即可得到兩因子的回歸模型，并通過Design－Expert 7.0軟件繪制出響應面曲線圖來進行直觀的分析。圖6～圖8分別顯示了3組以提取率為響應值的趨勢圖，從響應面圖可以直觀地反映出兩變量交互作用的顯著程度。極值條件出現(xiàn)在等高線的圓心處，等高線圖最圓，說明它們之間相互作用對杏仁蛋白的提取率的影響最大;而等高線圖越扁平，表示因素之間的相互影響越小。

從圖6可以看出，隨著pH的增大，杏仁蛋白的提取率逐漸增大;而隨著溫度的升高，杏仁蛋白的提取率呈先增后平的趨勢。

圖6 溫度和pH的交互作用對蛋白提取率的響應曲面Fig.6 Response surface showing the effects of temperature and pH on extraction yield

從圖7可以看出，隨著溫度的升高，超聲時間的延長，杏仁蛋白的提取率呈先增后減的趨勢。

從圖8可以看出，隨著pH增大，杏仁蛋白的提取率逐漸增大;而隨著時間的延長，杏仁蛋白的提取率的變化不明顯。

2.6 最佳條件的確定及驗證實驗

從圖3及Design－Expert 7.0軟件分析可得，建立了一個以苦杏仁蛋白質提取率為目標值，以超聲溫度、pH和時間為因子的數(shù)學模型。方差分析表明其擬合較好。通過對回歸方程的優(yōu)化計算，得到最佳提取工藝條件:在溫度47.76℃、提取時間1.18h，pH

圖7 溫度和時間的交互作用對蛋白提取率的響應曲面Fig.7 Response surface showing the effects of temperature and time on extraction yield

圖8 pH和時間的交互作用對蛋白提取率的響應曲面Fig.8 Response surface showing the effects of pH and time on extraction yield

3 結論

在單因素實驗基礎上，運用響應面分析法對提取杏仁油后杏仁渣中的蛋白的提取條件進行優(yōu)化。在超聲功率恒定，料液比為1∶30g/mL，得出對蛋白提取率影響大小的因素依次為提取時間、提取溫度、pH，驗證實驗進一步證明在溫度48℃、提取時間1.2h、pH 11時，蛋白質提取率高達79.74% ±0.60%，且外觀滿足食品加工要求，功能特性優(yōu)良。本研究為提取杏仁油后的工業(yè)廢棄物杏仁渣的有效利用提供了理論依據(jù)。為當?shù)匦尤实鞍椎倪M一步深加工提供了原料來源。

［1］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典:一部［S］.北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:187.

［2］于文清，劉曉輝.承德野生杏仁和杏葉蛋白質含量的測定［J］.承德民族師專學報，2011，31(2):54－56.

［3］杜琨，牟麗麗.杏仁的營養(yǎng)價值與開發(fā)利用［J］.食品研究與開發(fā)，2005，26(5):151.

［4］李建紅.甘肅省仁用杏栽培現(xiàn)狀與分析［J］.甘肅林業(yè)科技，2003，28(3):20.

［5］李宏睿，舒曉慧，程學輝.超聲波輔助提取杏仁油工藝研究［J］.中國糧油學報，2011，6(26):56－59.

［6］鄧剛，焦聰聰，許杭琳，等.超聲輔助提取佛手廢渣果膠的工藝優(yōu)化［J］.食品科學，2011，32(14):103－105.

［7］李鳳林，李應華.超聲波法提取白靈菇多糖的工藝研究［J］.食用菌，2009(3):74－75.

［8］田樺，張大偉，王惠娟.正交設計法優(yōu)化芍藥苷的超聲提取工藝［J］.黑龍江醫(yī)藥科學，2011，34(5):37－38.

［9］白靖文，葉非，賈旭.正交實驗優(yōu)選東北延胡索超聲輔助提取工藝［J］.中國醫(yī)院藥學雜志，2011，31(10):819－820.

［10］秦梅頌，時維靜，邢閂閂.正交實驗法優(yōu)選荷葉中總黃酮超聲提取工藝［J］.中獸醫(yī)藥雜志，2011(4):45－49.

［11］孫利偉，趙輝，蔡楠楠.正交實驗優(yōu)選杜仲中綠原酸的提取工藝［J］.中國藥業(yè)，2011，20(18):41－45.

［12］鄧翀，顏永剛，楊乖利，等.正交實驗設計優(yōu)化杜仲總木脂素提取工藝［J］.中國中醫(yī)藥信息雜志，2011，18(8):45－47.

［13］黃曉鈺，劉鄰渭.食品化學綜合實驗［M］.北京:中國農業(yè)大學出版社，2002:122.

［14］任燕冬，宋宏杉，陳巧云，等.超臨界二氧化碳萃取杏仁油的研究［J］.中國現(xiàn)代醫(yī)生，2011，49(13):61－62.