王 燕,毛 勇,李 飛,張志敏,張美麗,鄧 媛
(陜西省微生物研究所,陜西西安710043)
納他霉素(Natamycin)也稱游鏈霉素、匹馬菌素(Pimaricin)或海松素[1],是一種多烯烴大環(huán)內(nèi)酯類的抗真菌物質(zhì),對(duì)各種霉菌和酵母菌有高度抑制能力。納他霉素因其很難被人畜的消化道吸收,目前研究表明它對(duì)人畜無(wú)致癌、致畸和致敏等有害作用[2],所以作為一種天然的生物防腐劑已被批準(zhǔn)用于某些乳制品、肉類、飲料、水果等許多食品的生產(chǎn)和保藏之中[3]。但是由于納他霉素水溶性非常低(30~50mg/L)且不穩(wěn)定,造成納他霉素的生物利用度很低,成為它在行業(yè)中應(yīng)用的限制因素,影響了其制劑的開(kāi)發(fā)[4]。環(huán)糊精(cyclodextrin,簡(jiǎn)稱CD)是由環(huán)狀糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(CGTase)作用于淀粉得到的由6、7、8…個(gè)吡喃葡萄糖單元以α-1,4鍵連接的環(huán)狀低聚糖,結(jié)構(gòu)外形為“圓錐狀花環(huán)”,空腔內(nèi)部為疏水性空間,外部?jī)蓚?cè)為親水區(qū)域,能夠包合許多天然和人工合成的化合物分子,增加客體分子的穩(wěn)定性和溶解性[4-5]。其衍生物羥丙基-β-環(huán)糊精(HP-β-CD),可破壞環(huán)糊精分子內(nèi)氫鍵,在保持環(huán)糊精空腔的同時(shí)又克服了環(huán)糊精分子低水溶性的缺點(diǎn),顯著提高客體分子的水溶性[6]。蘇柘僮等人[7]研究表明,膽酸經(jīng) HP-β-CD包合后,溶解度增加11.81倍。魏海濤等人[8]研究表明,氟苯尼考-β-環(huán)糊精包合物在水中的溶解度平均約為氟苯尼考原藥的5.78倍。國(guó)外學(xué)者John L Koont Z等人[9]研究顯示,經(jīng) HP-β-CD 包合后納他霉素的溶解度增加了約152倍。國(guó)內(nèi)學(xué)者熊偉等人[10]研究顯示,經(jīng) HP-β-CD 包合后納他霉素的溶解度增加了約200多倍。本研究是以HP-β-CD包合后的納他霉素為材料,首先測(cè)定了包合物中納他霉素在水溶液中的溶解度,然后對(duì)包合后納他霉素的抗菌活性及生物穩(wěn)定性進(jìn)行研究,以期獲得溶解度高、抗菌活性好且穩(wěn)定性強(qiáng)的納他霉素,為納他霉素的防腐應(yīng)用提供理論依據(jù)。
納他霉素-HP-β-CD包合物 實(shí)驗(yàn)室自制;納他霉素(純度90%)安泰生物科技有限公司;孟加拉紅瓊脂培養(yǎng)基 北京陸橋生物科技有限公司生產(chǎn),批號(hào)為:1110182;HP-β-CD(含量98%)西安立德生物藥物科技有限公司;酵母菌2.394(Saccharomycescerevisiae)、白色念珠菌 2.2086(candida Albicans)、繩狀青霉 3.3872(Penicillium funiculosum)、黃曲霉3.3950(Aspergillus flavus)、黑曲霉 3.5387(Aspergillusniger)、米 曲 霉 3.2924(Aspergillusoryzae)、米 根 霉 3.2686(Rhizopus oryzae)、綠色木霉 3.2941(Trichoderma viride),鐮刀菌3.2835(Fusarium)由陜西省微生物所菌種保藏中心提供。
TU1901紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限公司;ZHWY-211C恒溫振蕩器 上海智城分析儀器制造有限公司;MJX-160/250C霉菌培養(yǎng)箱上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;GXZ智能光照培養(yǎng)箱 寧波東南儀器有限公司;GH-600ASB隔水培養(yǎng)箱 北京科偉永興儀器有限公司;PHSJ-4A型實(shí)驗(yàn)室PH計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司;強(qiáng)云牌ZSZ石英紫外線殺菌燈 北京強(qiáng)云特種燈泡廠;二孔A電熱恒溫水浴鍋 北京科偉永興儀器有限公司;BS224S電子精密天平 德國(guó)塞多利斯。
1.2.1 納他霉素的含量測(cè)定
1.2.1.1 測(cè)定波長(zhǎng)選擇 取適量納他霉素,加甲醇溶解,配制成一定的濃度,另取適量的羥丙基-β-環(huán)糊精用甲醇溶解配成溶液,分別用紫外分光光度計(jì)在200~400nm范圍內(nèi)進(jìn)行掃描。尋找納他霉素的最大吸收峰并確保羥丙基-β-環(huán)糊精在此處無(wú)吸收,以確定實(shí)驗(yàn)最佳檢測(cè)波長(zhǎng)。
1.2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密稱取1.0mg納他霉素對(duì)照品,加入到100mL的容量瓶中,用蒸餾水定容到100mL,配制成10mg/L的納他霉素標(biāo)準(zhǔn)品水溶液,標(biāo)記為母液。將母液作相應(yīng)稀釋,依次配制成2.0、4.0、6.0、8.0、10.0mg/L 的納他霉素標(biāo)準(zhǔn)品水溶液,在最佳波長(zhǎng)處測(cè)定吸收度,以吸收度(A)對(duì)質(zhì)量濃度(C)進(jìn)行線性回歸,得出線性回歸方程。
1.2.1.3 納他霉素含量的測(cè)定 將包合物和對(duì)照品做相應(yīng)稀釋后,在紫外分光光度計(jì)最佳波長(zhǎng)處測(cè)定吸收度,利用線性回歸方程,計(jì)算得出包合物和對(duì)照品中納他霉素的含量。
1.2.2 溶解度測(cè)定 采用平衡法:分別將過(guò)量包合物和對(duì)照品加入溶劑中,25℃的恒溫振蕩儀,以150r/min速率進(jìn)行平衡溶解,經(jīng)0.45μm孔徑濾膜過(guò)濾后取上清液測(cè)定303nm處吸收度,平行測(cè)量三次,取平均值。
1.2.3 包合物的抑菌性研究 此次實(shí)驗(yàn)采用瓊脂稀釋法測(cè)定在1×105cfu/mL菌液濃度下包合物和對(duì)照品的最低抑菌濃度(MIC)。通過(guò)觀察平板上實(shí)驗(yàn)菌株的生長(zhǎng)情況,以無(wú)菌生長(zhǎng)的濃度為MIC,表明藥物對(duì)實(shí)驗(yàn)菌株有抑制作用,單一菌落生長(zhǎng)的可忽略不計(jì)。
將納他霉素有效含量為40mg/kg的包合物溶液和對(duì)照溶液各取不同的量加入到滅菌冷卻至45℃的定量孟加拉紅瓊脂培養(yǎng)基中,混合均勻,傾注平板,每個(gè)濃度傾注兩個(gè)平皿。待其凝固后即為含不同納他霉素濃度的培養(yǎng)基。分別接種1×105cfu/mL各菌液0.1mL,涂布,28℃培養(yǎng)72h,觀察待測(cè)菌的生長(zhǎng)情況。
1.2.4 納他霉素包合物穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)
1.2.4.1 紫外照射對(duì)包合物中納他霉素穩(wěn)定性的影響 將包合物和對(duì)照品分別處理配制成含相同適宜濃度的納他霉素的水溶液,各取20mL置于無(wú)菌平皿內(nèi),同時(shí)放置在紫外光照強(qiáng)度20W,距離30cm處照射0、15、30、45、60、75、90min,以不處理的樣品為空白對(duì)照,根據(jù)1.2.1方法測(cè)定納他霉素相對(duì)含量。每組數(shù)據(jù)測(cè)量三次取平均值。
納他霉素相對(duì)含量(%)=A303(納他霉素測(cè)定)/A303(納他霉素初始)×100
1.2.4.2 光照對(duì)包合物中納他霉素穩(wěn)定性的影響將包合物和對(duì)照品分別處理配制成含相同適宜濃度的納他霉素的水溶液,分別取20mL加入到具塞的石英試管中,同時(shí)放置在光照培養(yǎng)箱(4500LX)中照射0、2、4、6、8、10d,以不處理的樣品為空白對(duì)照,根據(jù)1.2.1方法測(cè)定納他霉素相對(duì)含量。每組數(shù)據(jù)測(cè)量三次取平均值。
1.2.4.3 溫度對(duì)包合物中納他霉素穩(wěn)定性的影響將包合物和對(duì)照品分別處理配制成含相同適宜濃度的納他霉素的水溶液,分別平均分為5份,每份20mL,分別置于50、80、100、120℃條件下處理 0、30、60、90、120min,以未進(jìn)行溫度處理的樣品做為空白對(duì)照,根據(jù)1.2.1方法測(cè)定納他霉素相對(duì)含量。每組數(shù)據(jù)測(cè)量三次取平均值。
1.2.4.4 氧化劑對(duì)包合物中納他霉素穩(wěn)定性影響將包合物和對(duì)照品分別處理配制成含相同適宜濃度的納他霉素的水溶液,分別加入1%雙氧水?dāng)嚢杈鶆蜃饔?0、15、30、45、60、75、90min,以不加入雙氧水的樣品為空白對(duì)照,根據(jù)1.2.1方法測(cè)定納他霉素相對(duì)含量。每組數(shù)據(jù)測(cè)量三次取平均值。
1.2.4.5 pH對(duì)包合物中納他霉素穩(wěn)定性影響 將包合物和對(duì)照品分別處理配制成含相同適宜濃度的納他霉素的水溶液,分別平分9份,每份20mL,分別調(diào)pH 為 2、3、4、5、6、7、8、9、10,靜置 1h,以不處理的樣品為空白對(duì)照,根據(jù)1.2.1方法測(cè)定納他霉素相對(duì)含量。每組數(shù)據(jù)測(cè)量三次取平均值。
據(jù)1.2.1.1結(jié)果顯示納他霉素在303nm處有最大吸收峰,而羥丙基-β-環(huán)糊精在此處無(wú)吸收,故選303nm為最佳檢測(cè)波長(zhǎng)。據(jù)1.2.1.2結(jié)果顯示回歸方程為 A=0.1727C-0.0012,r2=0.9995,表明納他霉素吸收度與質(zhì)量濃度在2.0~10.0mg/L內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。
由表1可知:包合物中納他霉素的最大水溶度為61.58×103mg/L,是同等條件下對(duì)照品最大水溶度(34.37mg/L)的1792倍。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明:羥丙基-β-環(huán)糊精的包合能大幅度提高納他霉素的水溶度。
表1 包合物中納他霉素的水溶度Table 1 The water solubility of natamycin in the inclusion complex
由表2可知:在1×105cfu/mL菌液濃度下,包合物和對(duì)照品對(duì)8種常見(jiàn)真菌的MIC值完全相同。二者對(duì)黃曲霉的MIC值略有不同:包合物的MIC值為5mg/kg,而對(duì)照的MIC值為6mg/kg,說(shuō)明包合物對(duì)黃曲霉的抑菌效果強(qiáng)于對(duì)照品。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明:經(jīng)羥丙基-β-環(huán)糊精包合后的納他霉素,其原本的抑菌能力沒(méi)有減弱。
表2 包合物的最小抑菌濃度值(MIC)Table 2 The MIC of the inclusion complex
由表3可知:紫外線照射(強(qiáng)度20W,距離30cm處)90min對(duì)包合物和對(duì)照品中的納他霉素相對(duì)含量影響較大:包合物中納他霉素的相對(duì)含量由100%降低到61.90%,損失率為38.1%;對(duì)照品中納他霉素的相對(duì)含量由100%降低到31.05%,損失率為68.95%。但是在紫外處理15~90min的整個(gè)過(guò)程中,包合物中納他霉素相對(duì)含量值始終高于對(duì)照品。這是由于納他霉素在紫外光下分解,失去其中的四烯結(jié)構(gòu)所致穩(wěn)定性變差,而羥丙基-β-環(huán)糊精的包合,增加了納他霉素對(duì)紫外線的穩(wěn)定性。
由表4可知:光照(4500LX)處理10d對(duì)包合物和對(duì)照品中納他霉素相對(duì)含量影響較大:包合物中納他霉素的相對(duì)含量由100%降低到46.59%,損失率為53.41%;對(duì)照品中納他霉素的相對(duì)含量由100%降低到34.56%,損失率為65.44%。但是在日光處理2~10d的整個(gè)過(guò)程中,包合物中納他霉素相對(duì)含量均高于對(duì)照品。這是由于在納他霉素的分子結(jié)構(gòu)中,含有共軛不飽和的碳雙鍵,容易自氧化,光照在一定程度上促進(jìn)了這種氧化作用。而羥丙基-β-環(huán)糊精的包合,增加了納他霉素對(duì)光照的穩(wěn)定性。
由表5 可知:當(dāng)溫度 50、80、100、120℃處理 30~90min時(shí),包合物與對(duì)照品中納他霉素相對(duì)含量均較高(大于80%);當(dāng)120℃處理120min后,對(duì)照品中納他霉素的相對(duì)含量降低到80%以下,而包合物中納他霉素的相對(duì)含量仍高于80%。但是在整個(gè)處理過(guò)程中,包合物中納他霉素相對(duì)含量始終高于對(duì)照品。這是由于納他霉素具有一定的抗熱處理能力,能耐受短暫高溫,而羥丙基-β-環(huán)糊精的包合,增加了納他霉素在較高溫度環(huán)境中的穩(wěn)定性。
由表6可知:1%雙氧水處理90min,對(duì)包合物和對(duì)照品中納他霉素相對(duì)含量影響較明顯:包合物中納他霉素的相對(duì)含量由100%降低到36.03%,損失率為63.97%;對(duì)照品中納他霉素的相對(duì)含量由100%降低到35.79%,損失率為64.21%。但是在1%雙氧水處理15~90min的整個(gè)過(guò)程中,包合物中納他霉素相對(duì)含量始終高于對(duì)照品??梢?jiàn)羥丙基-β-環(huán)糊精的包合,在一定程度上增加了納他霉素對(duì)1%雙氧水的穩(wěn)定性。
表3 紫外線照射對(duì)包合物中納他霉素穩(wěn)定性的影響Table 3 Effect of ultraviolet light to natamycin’s stability in the inclusion complex
表4 光照對(duì)包合物中納他霉素穩(wěn)定性的影響Table 4 Effect of fluorescent lamp to natamycin’s stability in the inclusion complex
表5 溫度對(duì)包合物中納他霉素液穩(wěn)定性的影響Table 5 Effect of temperature to natamycin’s stability in the inclusion complex
表6 1%雙氧水對(duì)包合物中納他霉素穩(wěn)定性的影響Table 6 Effect of hydrogen peroxide to natamycin’s stability in the inclusion complex
表7 pH對(duì)包合物中納他霉素穩(wěn)定性影響Table 7 Effect of pH to natamycin’s stability in the inclusion complex
由表7可知:在pH4~9的范圍內(nèi),包合物和對(duì)照品的抑菌活性殘留率均較高(大于80%);在pH<4和pH>9時(shí),pH對(duì)包合物和對(duì)照品的抑菌活性殘留率影響均較大。但在整個(gè)pH2~10的范圍內(nèi),包合物中納他霉素的相對(duì)含量始終高于對(duì)照品。因?yàn)閺?qiáng)酸強(qiáng)堿容易使納他霉素分子結(jié)構(gòu)中的共軛的不飽和雙鍵降解,但是羥丙基-β-環(huán)糊精包合后,會(huì)使納他霉素的穩(wěn)定性有所提高。
納他霉素作為一種抗真菌劑在醫(yī)療、青儲(chǔ)飼料、糧儲(chǔ)、家禽養(yǎng)殖等方面有較好的抗菌效果,特別是在食品原料保鮮、成品防腐方面的應(yīng)用顯示了良好的前景[11]。但是由于低水溶性的缺點(diǎn),嚴(yán)重地制約了納他霉素更廣泛的開(kāi)發(fā)利用。近幾年各國(guó)學(xué)者對(duì)難溶分子主要通過(guò)生物轉(zhuǎn)化法,在分子骨架上添加極性基團(tuán),如膽酸鹽[12]、改性多糖[13-15],直接達(dá)到增溶的目的[16]。但其結(jié)果總是存在一定的缺陷:或者會(huì)顯示出較低的生物活性、或者會(huì)降低生物穩(wěn)定性有的甚至還會(huì)產(chǎn)生毒性。
環(huán)糊精(CD)由于外緣親水而內(nèi)腔疏水,它能夠像酶一樣提供一個(gè)疏水的結(jié)合部位,作為主體包絡(luò)各種適當(dāng)?shù)目腕w,從而有效地增加一些水溶性不良的分子在水中的溶解度和溶解速度。環(huán)糊精有多種同系物,目前應(yīng)用最廣泛的是 β-環(huán)糊精。羥丙基-β-環(huán)糊精是β-環(huán)糊精的衍生物之一,對(duì)許多化合物具有良好的包合作用,不僅能提高被包合物的水溶性,而且具有在生物體內(nèi)提高被包絡(luò)藥物的釋放速度和生物穩(wěn)定性的作用。
3.3.1 增加了納他霉素的水溶性 包合物中納他霉素最大水溶度為61.58×103mg/L,對(duì)照品的最大水溶度為34.37mg/L,前者的溶解度是后者的1792倍。羥丙基-β-環(huán)糊精的包合,極大地提高了納他霉素的水溶性。
3.3.2 提高了納他霉素的生物穩(wěn)定性 經(jīng)過(guò)紫外線照射15~90min、光照處理 2~10d、溫度(50、80、100、120℃)處理 30~120min、1%的雙氧水處理 15~90min或在pH2~10條件下作用1h后,包合物中納他霉素的相對(duì)含量與對(duì)照品相比均有增高的趨勢(shì)。羥丙基-β-環(huán)糊精的包合,提高了納他霉素的生物穩(wěn)定性。
3.3.3 保持了納他霉素良好的抗菌性 在1×105cfu/mL菌液濃度下,包合物和對(duì)照品對(duì)8種常見(jiàn)真菌的MIC值完全相同,且包合物對(duì)黃曲霉的抑菌效果要優(yōu)于對(duì)照品。羥丙基-β-環(huán)糊精的包合,使納他霉素保持了良好的抗菌性。
可見(jiàn)納他霉素-羥丙基-β-環(huán)糊包合物,不僅能大幅提高納他霉素的水溶性,還能提高其生物穩(wěn)定性,同時(shí)又不降低其抗菌活性,為日后納他霉素-羥丙基-β-環(huán)糊包合物的工業(yè)化生產(chǎn)提供理論基礎(chǔ)并且為納他霉素的應(yīng)用提供了更多的空間。
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