鐵欏葉揮發(fā)油成分及生物活性研究

張大帥，王 燕，陳光英，王 菁，劉莉莉，唐 娟，尚清清，趙王丹，陳文豪

(海南師范大學(xué)“省部共建－熱帶藥用植物化學(xué)”教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，化學(xué)與化工學(xué)院，海南海口571158)

鐵欏(Amoora tsangii(Merr.)X.M.Chen)為楝科崖摩屬(Amoora)植物，產(chǎn)自海南，其地上部位在民間作為蠕蟲(chóng)藥使用［1］。有研究報(bào)道從鐵欏枝葉中得到了7個(gè)新檸檬苦素類似物amotsangins A－G(1－7)，2個(gè)已知檸檬苦素類似物和4個(gè)已知倍半萜類化合物［2］，但并未見(jiàn)有關(guān)生物活性的研究報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)利用水蒸氣蒸餾法提取鐵欏葉揮發(fā)油，采用GC－MS聯(lián)用技術(shù)分析其的化學(xué)成分;并采用紙片瓊脂擴(kuò)散法和MTT比色法分別研究其抗菌、抗腫瘤活性。本文首次對(duì)鐵欏葉的揮發(fā)油的化學(xué)成分和抗菌及抗腫瘤活性進(jìn)行了研究，為研究鐵欏葉的藥用價(jià)值提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鐵欏葉 2012年9月采自海南三亞，經(jīng)海南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院鐘瓊芯教授鑒定為鐵欏葉，其標(biāo)本保存于海南師范大學(xué)熱帶藥用植物化學(xué)省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;供試菌種:金黃色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus Rosenbach)、大腸桿菌(Escherichia coli)、枯草桿菌(Bacillus subtilis);肺腺癌細(xì)胞SPCA－1 南方醫(yī)科大學(xué);肝癌細(xì)胞 BEL－7402 中國(guó)科學(xué)院上海藥物所;胃癌細(xì)胞 SGC－7901、白血病細(xì)胞K562 中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院;RPMI1640培養(yǎng)液、胰酶 Gibco公司;MTT Sigma公司;其它試劑 均為市售分析純?cè)噭?/p>

7890A/5975C－GC/MSD氣質(zhì)聯(lián)用儀 Agilent公司;Elx800酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀 BioTek公司;倒置顯微鏡 重慶光學(xué)儀器廠;MCO－15AC CO2恒溫培養(yǎng)箱 SANYO公司;冷凍干燥機(jī) 北京四環(huán)科學(xué)儀器廠;電子天平 Sartious公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)條件

［3］的方法。GC條件:石英毛細(xì)管柱HP－FFAP(30m ×0.25mm，0.25μm)，程序升溫，起始溫度50℃，保持1min，以5℃/min升溫速率，升溫到230℃保持5min，再以8℃/min升溫速率，升溫到280℃，然后保持至完成分析，載氣為He(99.99%)，柱流量1.0mL/min，壓力28.8kPa，進(jìn)樣口溫度250℃，分流比 50∶1。

MS條件:EI源，電子能量為70eV，接口溫度為280℃，離子源溫度為230℃，四級(jí)桿溫度為180℃，溶劑延遲為2.5min，全掃描(Scan)采集模式，質(zhì)量范圍m/z 50～550u，掃描間隔0.50s，倍增器電壓1200V。

1.3 揮發(fā)油的提取

新鮮鐵欏葉總重600g，剪碎，分2次用水蒸氣蒸餾法提取8h，再用無(wú)水乙醚萃取，萃取液加無(wú)水硫酸鎂干燥，水浴蒸餾回收乙醚，最后得淡黃色油狀物，具有濃郁的芳香味，重量為2.525g，得油率為0.42%。

1.4 體外抗菌實(shí)驗(yàn)

將鐵欏葉揮發(fā)油配制多個(gè)濃度梯度，置冰箱(4℃)。用接種環(huán)從斜面上劃取一環(huán)菌苔，溶于10mL的無(wú)菌水中，得菌懸液。將培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿中，用移液器取0.2mL菌懸液注入平板涂布均勻，在已接種的平板上放入浸泡在不同濃度樣品的濾紙片，用溶劑的濾紙片作為對(duì)照，以上操作均在無(wú)菌條件下進(jìn)行。培養(yǎng)24h，觀察結(jié)果。用游標(biāo)卡尺采用十字交叉法測(cè)量其抑菌圈大小，然后取平均值，由抑菌圈大小比較說(shuō)明抑菌作用的強(qiáng)弱［4］。

1.5 體外抗腫瘤實(shí)驗(yàn)

收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞，配制細(xì)胞懸液，調(diào)整其細(xì)胞密度為10000個(gè)/mL，于96孔板中鋪板。培養(yǎng)8～12h后。加入濃度梯度的揮發(fā)油(1、10、100μg/mL三個(gè)濃度)20μL，培養(yǎng)44h。加入MTT溶液繼續(xù)培養(yǎng)4h。吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)，加入 DMSO，振蕩10min，顯出藍(lán)紫色。在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上選擇570nm，用空白孔調(diào)零，測(cè)定各孔的吸光值，記錄結(jié)果，計(jì)算抑制率。以濃度的對(duì)數(shù)值作橫坐標(biāo)，以抑制率作縱坐標(biāo)，作回歸曲線，計(jì)算。

2 結(jié)果與分析

2.1 鐵欏葉揮發(fā)油分析

采用GC－MS分析鐵欏葉揮發(fā)油的化學(xué)成分，應(yīng)用面積歸一化法分析其總離子流圖(圖1)得出各成分百分含量，將總離子流圖通過(guò)譜數(shù)據(jù)庫(kù)檢索和文獻(xiàn)資料核對(duì)，確定了其中的52個(gè)成分，結(jié)果見(jiàn)表1。鐵欏葉揮發(fā)油的化學(xué)成分主要以倍半萜類化合物(79.15%)，(倍半萜烯化合物(59.94%)和氧化的倍半萜烯(19.21%)、醇類(5.59%)和酯類(5.17%)為主，其中含量較高的成分有石竹烯(20.58%)，(1S－順式)－1，2，4A，5，6，8A－六氫化－4，7－二甲基－1－(甲基乙基)－萘(8.16%)，tau.－muurolol(7.32%)，橙花叔醇(6.82%)等。

圖1 鐵欏葉揮發(fā)油的總離子流圖Fig.1 Total ion chromatogram of the essential oil from the leaves of A.tsangii

2.2 鐵欏葉揮發(fā)油體外抗菌結(jié)果

測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。鐵欏葉揮發(fā)油對(duì)供試菌種均有不同程度的抑制作用，且隨揮發(fā)油劑量增加而增強(qiáng)。

表1 鐵羅葉揮發(fā)油的化學(xué)成分Table 1 Chemical constituents of essential oil from the leaves of A.tsangii

續(xù)表

續(xù)表

表2 鐵欏葉揮發(fā)油抑菌活性表Table 2 Antimicrobial activity of essential oil from the leaves of A.tsangii

2.3 鐵欏葉揮發(fā)油抗腫瘤結(jié)果

測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3。鐵欏葉揮發(fā)油對(duì)四種細(xì)胞均有一定的抑制活性;對(duì)SPCA－1和BEL－7402的抑制率大于50%。測(cè)試對(duì)這兩種癌細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度IC50。結(jié)果表明，其對(duì)SPCA－1的抑制活性最強(qiáng)，IC50值為11.2μg/mL;對(duì) BEL－7402 的 IC50值為35.52μg/mL。

表3 鐵欏葉揮發(fā)油對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的IC50值Table 3 The antitumor activity with IC50values of essential oil from the leaves of A.tsangii

3 結(jié)論

文獻(xiàn)報(bào)道，Chiang［6］等通過(guò) GC/MS分析鐵欏同屬植物A.rohituka葉和果實(shí)的揮發(fā)油，發(fā)現(xiàn)其葉和果均富含倍半萜類化合物，葉和果的含量分別為90.4%和87%。同時(shí)發(fā)現(xiàn)兩部位的揮發(fā)油均表現(xiàn)出顯著的抗菌活性。本研究發(fā)現(xiàn)鐵欏葉的揮發(fā)油中同樣是倍半萜類化合物含量較高(79.15%)。其中石竹烯(20.58%)的含量最高，該類化合物具有局部麻醉作用和治療結(jié)腸炎作用［7］;同時(shí)可以和空氣中的微粒形成容易被植物吸收的顆粒，起到凈化空氣的作用［8］;研究發(fā)現(xiàn)β－石竹烯對(duì)小鼠口服給藥，能夠保護(hù)胃黏膜不受乙醇強(qiáng)酸等致炎因子的損傷，同時(shí)不影響胃酸的分泌，而表現(xiàn)出很好的抗?jié)兒涂寡鬃饔茫?］;從番荔枝樹(shù)皮的石油醚提取物中提取到的石竹烯氧化物具有很好的鎮(zhèn)痛和抗炎作用［10］。鐵欏葉的揮發(fā)油中石竹烯(20.58%)的含量最高，推導(dǎo)其應(yīng)有一定的抗菌活性?？咕鷮?shí)驗(yàn)表明，鐵欏葉揮發(fā)油對(duì)供試菌種(金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草桿菌)均表現(xiàn)出不同程度的抑制作用，且呈量效關(guān)系;另外，鐵欏葉揮發(fā)油對(duì)四種癌細(xì)胞(SPCA－1、BEL－7402、SGC－7901、K562)均有一定的增殖抑制活性，其中對(duì)SPCA－1 的抑制活性最強(qiáng)，IC50值達(dá)11.2μg/mL。

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