慢病毒載體介導(dǎo)IL-24基因轉(zhuǎn)導(dǎo)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究

祁秋干 周清華 李印 李偉強(qiáng) 陳霏 秦建軍

腫瘤的復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移是腫瘤治療失敗的主要原因，能準(zhǔn)確發(fā)現(xiàn)腫瘤的微衛(wèi)星灶，并將治療藥物靶向作用于腫瘤部位，是治療腫瘤直接而有效的途徑。近來研究[1]發(fā)現(xiàn)干細(xì)胞具有向腫瘤定向遷移的特性，利用干細(xì)胞為載體攜帶治療基因或藥物靶向治療腫瘤可能是腫瘤治療的新突破。人骨髓來源的間充質(zhì)細(xì)胞（human bone marrow mesenchymal stem cells, hBMSCs）具有在不同的誘導(dǎo)條件下向內(nèi)胚層、中胚層和外胚層的所有類型細(xì)胞分化的潛能[2]， 而且取材方便、體外分離與增殖技術(shù)成熟等特點(diǎn)，在干細(xì)胞移植和基因治療中頗受青睞[3,4]。

白細(xì)胞介素-24（interleukin-24, IL-24）又稱黑色素瘤分化相關(guān)基因-7（melanoma differentiation associated gene 7, MDA-7）是又一個(gè)既能抑制腫瘤細(xì)胞生長和血管形成并誘導(dǎo)凋亡，同時(shí)又能刺激免疫細(xì)胞表達(dá)細(xì)胞因子的新型抑癌基因[5,6]。選擇性清除腫瘤細(xì)胞，而不損傷正常細(xì)胞，是最廣泛的“靶向”概念。腫瘤基因治療成功的關(guān)鍵在于有效基因載體的選擇，可以攜帶治療因子釋放到相應(yīng)的靶器官而發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。

實(shí)驗(yàn)基于以上研究背景，通過多位點(diǎn)Gateway技術(shù)[7]構(gòu)建了攜帶IL-24基因的慢病毒表達(dá)載體pLVpuro/EF1-IL-24-IRES-EGFP，將其包裝成慢病毒，轉(zhuǎn)導(dǎo)入hBMSCs，使用嘌呤霉素進(jìn)行篩選純化，以獲得過表達(dá)外源基因IL-24及報(bào)告基因EGFP的綠色熒光細(xì)胞，利用EGFP基因?qū)崿F(xiàn)目的基因在體內(nèi)外表達(dá)的示蹤定位，為下一步開展基因治療相關(guān)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 帶啟動(dòng)子的入門克隆pUp-EF1α、帶報(bào)告基因的入門克隆pTail-IRES-EGFP、目的載體pDEST-puromycin、入門載體pDONRTM221、ViraPowerTMLentiviral Packaging Mix、BP ClonaseTMII和LR ClonaseTMII、LipofectamineTM2000、OneShot? Stbl3 Chemically Competent E. coli、239FT細(xì)胞株、CD分子單抗（CD29-APC、CD90-PE、CD34-FITC、CD45- FITC）均購自美國Invitrogen公司，hBMSCs由中山大學(xué)干細(xì)胞中心提供，CDS克?。ê琁L-24基因）由中山大學(xué)干細(xì)胞中心項(xiàng)鵬教授饋贈，重組人IL-24 ELISA試劑盒購自美國RD公司，胎牛血清及L-DMEM均購自Gibco公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 入門克隆pDown-IL-24的構(gòu)建和鑒定 引物設(shè)計(jì)：根據(jù)Genebank中IL-24基因（NM_006850）的cDNA序列，設(shè)計(jì)IL-24引物序列為： Forward: 5’-GGGG ACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTCCATCGATGGATGAATTTTCAACAGAGGCTG-3’; Reverse: 5’-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTACGGGATCCTCAGAGCTTGT AGA ATTTC-3’。PCR擴(kuò)增：在上述引物的作用下，以IL-24的cDNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，電泳檢測PCR產(chǎn)物，切膠回收純化目的條帶。BP重組反應(yīng)：用側(cè)翼含attB位點(diǎn)的PCR產(chǎn)物與入門載體pDONRTM221進(jìn)行重組反應(yīng)。取2 μL反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化50 μL Stbl3感受態(tài)細(xì)胞。細(xì)胞涂布于含有50 mg/L卡那霉素的LB平板，37oC過夜培養(yǎng)。鑒定：從平板挑單克隆接種于LB液體培養(yǎng)液中，37oC、220 r/min振搖過夜培養(yǎng)，菌液行PCR擴(kuò)增驗(yàn)證，挑取構(gòu)建正確的菌落培養(yǎng)過夜，提取質(zhì)粒DNA，測序驗(yàn)證。

1.2.2 表達(dá)克隆pLVpuro/EF1α-IL-24-IRES-EGFP的構(gòu)建和鑒定 將入門克隆pUp-EF1α、pDown-IL-24和pTail-IRES-EGFP與目的載體pDEST-puromycin在LR重組反應(yīng)酶作用下重組，取2 μL重組反應(yīng)液轉(zhuǎn)化50 μL Stbl3感受態(tài)細(xì)胞，氨卞西林LB培養(yǎng)平板篩選陽性重組克隆并擴(kuò)增，菌液行PCR擴(kuò)增驗(yàn)證，挑取構(gòu)建正確的菌落培養(yǎng)過夜，提取質(zhì)粒DNA，測序驗(yàn)證。

1.2.3 慢病毒的包裝和濃縮 將慢病毒包裝質(zhì)粒ViraPowerTMLentiviral Packaging Mix和載體質(zhì)粒pLVpuro/EF1α-IL-24-IRES-EGFP以1:1的摩爾比例混合,在LipofectamineTM2000的作用下共轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞，置于37oC、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。12h 后換液，加入新鮮293FT細(xì)胞培養(yǎng)液。72h 后觀察有強(qiáng)綠色熒光及細(xì)胞融合現(xiàn)象時(shí)收集培養(yǎng)上清，4oC、4,500 r/min離心15 min，將病毒上清液用0.45 μm濾膜過濾以去除細(xì)胞碎片，4oC、50,000g高速離心90 min。用RNase-free L-DMEM懸浮病毒顆粒沉淀，標(biāo)記LVIL-24，-80oC凍存?zhèn)溆?。同法?gòu)建只含EGFP的空病毒，標(biāo)記LV-EGFP。

1.2.4 慢病毒的滴度測定 接種293FT細(xì)胞于6孔板，每孔接種2×105個(gè)細(xì)胞，37oC培養(yǎng)過夜；第2天，將慢病毒溶液用無血清DMEM（不含抗生素）按1×10-2、1×10-3、1×10-4、1×10-5、1×10-6、1×10-7進(jìn)行系列稀釋，將其分別加入到相應(yīng)的孔中，加入聚酰胺（Polybrene）終濃度至6 mg/L，置37oC、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。12 h后全量換液，加入新鮮的293FT培養(yǎng)液。第4天觀察熒光表達(dá)情況，熒光細(xì)胞數(shù)隨稀釋倍數(shù)增加而減少，計(jì)數(shù)出表達(dá)熒光的細(xì)胞個(gè)數(shù)，將得到的數(shù)值乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)就得到病毒原液的滴度數(shù)。

1.2.5 hBMSCs培養(yǎng)及鑒定 常規(guī)復(fù)蘇凍存的hBMSCs，用含10%胎牛血清的L-DMEM培養(yǎng)液，置于置37oC、5%CO2的培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每2-3天常規(guī)換液。待細(xì)胞長至80%-90%融合時(shí)，用0.25%胰蛋白酶消化傳代，傳代后約1周左右達(dá)90%融合。免疫組化及流式細(xì)胞術(shù)鑒定細(xì)胞表面標(biāo)志物CD29、CD90、CD34和CD45。

1.2.6 慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)hBMSCs及純化 用慢病毒LV-IL-24及LV-EGFP進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)傳代后狀態(tài)較好的hBMSCs，設(shè)單純hBMSCs為對照。分別加入病毒懸液20 μL和Polybrene（終濃度6 mg/L），置37oC、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。12 h后去除含病毒的培養(yǎng)液，換為L-DMEM培養(yǎng)液。連續(xù)感染3次后用L-DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)導(dǎo)后為了得到純化的感染細(xì)胞群，在轉(zhuǎn)導(dǎo)后第7天開始使用1 mg/L-5 mg/L嘌呤霉素進(jìn)行篩選，篩選時(shí)間為7 d-10 d。純化后轉(zhuǎn)入IL-24基因的hBMSCs標(biāo)記為hBMSCs-IL-24；轉(zhuǎn)入EGFP基因的hBMSCs標(biāo)記為hBMSCs-EGFP。

1.2.7 轉(zhuǎn)導(dǎo)純化后的hBMSCs的鑒定分析 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（quantitative PCR, qPCR）檢測：收集hBMSCs-IL-24組、hBMSCs-EGFP組及對照組hBMSCs細(xì)胞，提取各組RNA，反轉(zhuǎn)錄cDNA，然后以cDNA為模板，行qPCR檢測各組中IL-24 mRNA的表達(dá)水平。 ELISA檢測：收集hBMSCs-IL-24組、hBMSCs-EGFP組及對照組hBMSCs細(xì)胞培養(yǎng)液上清，根據(jù)重組人IL-24 ELISA試劑盒操作說明檢測各組細(xì)胞的IL-24蛋白濃度水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對IL-24評分結(jié)果進(jìn)行單因素方差分析（one-way ANOVA），P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 入門克隆pDown-IL-24的鑒定 經(jīng)BP重組反應(yīng)，挑選兩個(gè)入門克隆陽性菌落，質(zhì)粒PCR擴(kuò)增片段大小在600 bp-700 bp之間，與IL-24基因理論值一致（621 bp），見圖1。挑取構(gòu)建正確的菌落培養(yǎng)過夜后提取質(zhì)粒DNA，經(jīng)測序鑒定目的基因序列與數(shù)據(jù)庫的IL-24基因序列吻合，表明成功構(gòu)建入門克?。╬Down-IL-24）。

2.2 表達(dá)克隆pLVpuro/EF1α-IL-24-IRES-EGFP的構(gòu)建和鑒定 經(jīng)LR重組得到了表達(dá)克隆陽性菌落，提取克隆提取質(zhì)粒行PCR擴(kuò)增出目的片段包括表達(dá)基因IL-24（621 bp）、啟動(dòng)子EF1α（1,264 bp）和報(bào)告基因EGFP（750 bp），結(jié)果與基因片段大小相符（圖2）。

2.3 慢病毒的包裝與濃縮 慢病毒載體共同轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞72 h后，在熒光顯微鏡下觀察，轉(zhuǎn)IL-24基因組及空病毒載體組均可見大量強(qiáng)綠色熒光，證實(shí)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入293FT細(xì)胞，細(xì)胞部分融合，可見多核復(fù)合體出現(xiàn)（圖3）。收集病毒上清液高速離心后，用100 μL RNase-free L-DMEM分別溶解病毒顆粒。

2.4 慢病毒的滴度測定 將病毒原液（LV-IL-24）從1×10-2到1×10-7梯度稀釋后，感染293FT細(xì)胞2 d后，可見1×10-2到1×10-5孔均出現(xiàn)大量陽性細(xì)胞，而1×10-6到1×10-7孔陽性細(xì)胞數(shù)分別為45個(gè)和10個(gè)，根據(jù)公式病毒滴度=陽性細(xì)胞數(shù)×病毒上清稀釋倍數(shù)，取1×10-6到1×10-7孔兩孔平均值得出LV-IL-24病毒滴度為：7.25×107PFU/mL；同法測空病毒（LV-EGFP）滴度為8.12×107PFU/mL。

2.5 hBMSCs培養(yǎng)及鑒定 常規(guī)復(fù)蘇hBMSCs后約7 d到達(dá)90%融合，細(xì)胞的排列呈典型的漩渦樣，單個(gè)細(xì)胞呈典型紡錘型。經(jīng)1:3比例傳代之后，細(xì)胞經(jīng)3 d-4 d培養(yǎng)可以達(dá)到融合90%以上并適于再次傳代。流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果顯示：hBMSCs均一性可達(dá)95%以上，hBMSCs高表達(dá)CD29、CD90，不表達(dá)DCD34、CD4（圖4）。

2.6 慢病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)純化后hBMSCs綠色熒光觀察 慢病毒（LV-IL-24, LV-EGFP）轉(zhuǎn)染hBMSCs 72 h后，熒光顯微鏡下觀察到部分細(xì)胞表達(dá)綠色熒光。7 d后，鏡下可見綠色熒光細(xì)胞明顯增多，此時(shí)開始加入嘌呤霉素進(jìn)行篩選，維持時(shí)間為7 d-10 d，期間細(xì)胞常規(guī)傳代，篩選結(jié)束后，即可得到攜帶慢病毒載體的綠色熒光細(xì)胞群（圖5）。

2.7 轉(zhuǎn)導(dǎo)純化后的hBMSCs的鑒定分析 qPCR檢測結(jié)果：hBMSCs組與hBMSCs-EGFP組可檢測到IL-24 mRNA少量表達(dá)，而hBMSCs-IL-24組可檢測到IL-24 mRNA明顯表達(dá)（P＜0.05）（圖6）。ELISA檢測結(jié)果：hBMSCs組與hBMSCs-EGFP組中幾乎檢測不到IL-24的濃度水平， hBMSCs-IL-24組中IL-24的濃度可到達(dá)40 μg/L，表明IL-24基因成功轉(zhuǎn)入到hBMSCs中。

3 討論

hBMSCs是具有多向分化潛能的干細(xì)胞，在體外能貼壁培養(yǎng)和大量擴(kuò)增，hBMSCs屬成體干細(xì)胞，不僅可以向中胚層分化，在特定條件下，還能實(shí)現(xiàn)跨系統(tǒng)分化[8,9]，其植入體內(nèi)無免疫排斥反應(yīng)，并且能廣泛遷移，易于組織整合而發(fā)揮功能，都提示其在基因治療中可能成為非常有價(jià)值的運(yùn)載細(xì)胞[10-12]。而且多項(xiàng)研究[1,13]表明，hBMSCs在體內(nèi)有向腫瘤微環(huán)境趨向轉(zhuǎn)移的特性。將hBMSCs作為細(xì)胞載體開展腫瘤的基因治療是目前研究的熱點(diǎn)之一。

慢病毒屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒的一種[14]，可以高效感染處于分裂期和非分裂期的細(xì)胞；借助慢病毒可將其攜帶的外源基因高效整合進(jìn)宿主細(xì)胞基因組中，外源基因可在細(xì)胞內(nèi)長期穩(wěn)定表達(dá)。應(yīng)用Gateway技術(shù)構(gòu)建慢病毒載體已得到廣泛應(yīng)用[15]，明顯簡化了基因克隆和亞克隆的步驟，避免了假陽性的出現(xiàn)，使基因克隆更加方便易行。

圖1 入門克隆PCR鑒定結(jié)果Fig1 PCR identification results of entry clone

圖2 表達(dá)克隆PCR鑒定結(jié)果Fig2 PCR identification results of expression cloning

圖3 轉(zhuǎn)染72 h的293FT細(xì)胞綠色熒光Fig3 The green fluorescent of 293 FT cells after transfection for 72 h

圖4 人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（human bone marrow mesenchymal stem cells, hBMSCs）表面抗原標(biāo)志Fig4 Surface antigen mark of hBMSCs

圖5 慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)純化后hBMSCs的綠色熒光表達(dá)情況Fig5 The green fluorescent after lentivirus transducs hBMSCs

圖6 qPCR檢測IL-24 mRNA表達(dá)。*: P＜0.05Fig6 Expression of IL-24 mRNA detected by qPCR. *: P＜0.05

hBMSCs具有取材方便、體外易培養(yǎng)、強(qiáng)大的遷移能力及高效安全的外源基因表達(dá)能力等優(yōu)點(diǎn)，故被認(rèn)為是組織工程和基因工程理想的靶細(xì)胞[16,17]。選擇構(gòu)建以慢病毒為載體的表達(dá)系統(tǒng)，對于較難轉(zhuǎn)染的干細(xì)胞，能明顯提高目的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，該載體可以將外源基因有效地整合到宿主染色體上，從而達(dá)到持久性表達(dá)[18]。本實(shí)驗(yàn)利用Gateway技術(shù)成功構(gòu)建了慢病毒表達(dá)載體（pLVpuro/EF1α-IL-24-IRES-EGFP），將其包裝成慢病毒，同時(shí)將攜帶有目的基因的慢病毒成功轉(zhuǎn)導(dǎo)hBMSCs，編碼出來的綠色熒光蛋白和目的基因蛋白不是融合蛋白，而是各具獨(dú)立空間結(jié)構(gòu)和生理活性，有利于目的基因蛋白的表達(dá)鑒定及定位追蹤[19]，同時(shí)為利用干細(xì)胞作為細(xì)胞載體攜帶治療基因或藥物靶向治療腫瘤提供新的理論依據(jù)。