EML4-ALK抑制劑在非小細(xì)胞肺癌中發(fā)生耐藥的機(jī)制

吳荻 于鴻 李佳美

非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）約占肺癌總數(shù)的80%-85%，是最常見的惡性腫瘤之一。繼表皮生長因子受體（epithelial growth factor receptor,EGFR）基因突變在NSCLC發(fā)生過程中的機(jī)制逐漸明晰后，NSCLC的靶向治療已經(jīng)成為臨床實踐的熱點(diǎn)[1]。近年來的研究[2]發(fā)現(xiàn)了一種新的癌基因，棘皮動物微管相關(guān)蛋白樣4-間變性淋巴瘤激酶（echinoderm microtubuleassociated protein-like 4-anaplastic lymphoma kinase, EML4-ALK）參與了NSCLC的發(fā)生過程。以EML4-ALK為靶點(diǎn)的分子靶向藥物的應(yīng)用成為治療NSCLC的焦點(diǎn)，包括克唑替尼（crizotinib）在內(nèi)的多種酪氨酸激酶抑制劑（tyrosine kinase inhibitors, TKI）在臨床前期研究以及對ALK易位癌癥患者的治療中取得良好的療效[3,4]。雖然該藥在2011年已被FDA批準(zhǔn)，但并不是所有的患者均能從治療中獲益，一部分患者經(jīng)治后疾病進(jìn)展，產(chǎn)生獲得性耐藥；還有很少的一部分患者初治即發(fā)生耐藥，因此探究TKI耐藥機(jī)制具有重要的臨床意義，闡明其耐藥性機(jī)制將有利于制定克服臨床耐藥性發(fā)生的新策略[5]。本文將詳述目前已知的耐藥機(jī)制。

1 ALK激酶區(qū)域突變

一個公認(rèn)的TKI獲得性耐藥的機(jī)制是在激酶域ATP結(jié)合位點(diǎn)發(fā)生集群性突變[6,7]。Crizotinib的耐藥機(jī)制研究仍在探索中，從所有經(jīng)過crizotinib治療的NSCLC以及炎性肌纖維母細(xì)胞瘤（inflammatory myofibroblastic tumor,IMT）患者中證實的幾種二次突變都已公開報道[8,9]。2008年，Choi等[10]首次報道在臨床治療中發(fā)現(xiàn)一例患者持續(xù)應(yīng)用crizotinib后腫瘤繼續(xù)增長。推測可能發(fā)生了基因的二次突變，誘發(fā)繼發(fā)性耐藥。研究組利用Sanger測序在73例EML4-ALK陽性患者胸腔積液標(biāo)本中檢測到序列4374G→A和4493C→A兩種基因突變，其中，34例（46.6%）呈4374G→A陽性；11例（15.1%）呈4493C→A陽性。相應(yīng)序列1156和1196表達(dá)的氨基酸發(fā)生了改變。其余28例（38.4 %）兩個點(diǎn)突變均為陰性。C1156和L1196都位于ALK激酶域，其中C1156位于預(yù)測的螺旋αC氨基末端，接近ATP結(jié)合區(qū)域上部邊緣；L1196則位于ATP結(jié)合區(qū)域底部“gatekeeper”處，這種帶著大分子側(cè)鏈的氨基酸可能會干擾TKI的結(jié)合。

2010年，Sasaki等[9]也證實L1196突變可能創(chuàng)建了一個空間位阻阻止crizotinib的結(jié)合。而F1174L突變可能促進(jìn)ALK活化構(gòu)象的產(chǎn)生，從而不利于crizotinib的結(jié)合，使其優(yōu)先結(jié)合無效構(gòu)象ALK。2011年，發(fā)現(xiàn)一種新的ALK TKI耐藥機(jī)制，即在ALK和活化的EGFR信號中的一個二次突變（L1152R），導(dǎo)致在1152位置上的亮氨酸被精氨酸取代[6]。值得注意的是這些突變可以發(fā)生在同一個腫瘤中，故在制定克服臨床耐藥的策略時應(yīng)該充分認(rèn)識到耐藥機(jī)制的復(fù)雜性[11]。

在已經(jīng)鑒定的各種不同EML4-ALK亞型中，沒有任何證據(jù)表明特定EML4-ALK亞型獲得性耐藥的機(jī)制會有所不同。此外，L1152R突變與F1174L突變不同，其對另外一個ALK抑制劑TAE684敏感性不同，故需要結(jié)構(gòu)獨(dú)特的ALK抑制劑克服這種突變。有幾種新型抑制劑正在臨床前開發(fā)階段。與此同時，Zhang等[12]鑒定了在激酶活性部位周圍的5個區(qū)域的殘基突變，除已知的C1156、F1174、L1196和L1152等突變外，還檢測到另外兩種新的二次突變S1206和I1171。相信隨著對ELM4-ALK融合基因研究的深入，可能會發(fā)現(xiàn)更多不同突變會導(dǎo)致耐藥性的發(fā)生。

2012年，Doebele等[13]通過直接對ALK外顯子21-25（編碼激酶區(qū)域）進(jìn)行測序，分析了14例患者ALK重組的NSCLC組織，其中11例有分子分析的評估價值，4例（36%）在ALK酪氨酸激酶區(qū)域產(chǎn)生二次突變，2例在相應(yīng)區(qū)域編碼L1196M替代氨基酸。該基因在經(jīng)典的“gatekeeper”基因水平上與T315I和T790M同源；有2例在ALK編碼區(qū)域發(fā)生一種新的二次基因突變（G1269A），位于ALK的ATP結(jié)合區(qū)末端，原來的甘氨酸被較大的丙氨酸取代，形成一定的空間位阻阻礙crizotinib的結(jié)合。體外實驗證明，與野生型相比，G1269A能夠促進(jìn)ALK永久性磷酸化，激活下游效應(yīng)器，發(fā)生crizotinib耐藥。

同在2012年，Katayama等[14]探討了經(jīng)crizotinib治療后的耐藥屬于繼發(fā)性耐藥還是原發(fā)性耐藥的問題。針對18例crizotinib經(jīng)治耐藥患者的樣本，他們進(jìn)行了治療基線與耐藥后組織總核酸測序以及ALK激酶域的標(biāo)準(zhǔn)Sanger測序。 在相應(yīng)crizotinib耐藥樣本中未發(fā)現(xiàn)其治療前基線組織存在ALK突變。使用等位基因特異的PCR檢測法進(jìn)行再確認(rèn)，所得結(jié)果與前次實驗一致。這表明crizotinib的耐藥突變在治療前的腫瘤組織中并不普遍。通過對外顯子20-28對應(yīng)的ALK酪氨酸激酶域測序。在18例crizotinib耐藥患者中，發(fā)現(xiàn)4種耐藥突變：3種錯義突變(L1196M、G1202R和S1206Y）以及1種氨基酸（蘇氨酸）插入突變(1151Tins）。L1196M替代氨基酸突變既往已被公開報道。G1202R突變與伊馬替尼耐藥的BCR-ABL突變（G340W）類似。其它兩個突變（1151T插入和S1206Y）似乎為ALK和crizotinib耐藥所特有。G1202R和S1206Y都位于鄰接crizotinib結(jié)合位點(diǎn)激酶結(jié)構(gòu)域的溶劑暴露區(qū)域。推測1151Tins殘基位于α螺旋C的N末端環(huán)路遠(yuǎn)端，此位置與crizotinib結(jié)合位點(diǎn)并不相鄰。推測該突變可能會影響ALK對ATP的親和力，導(dǎo)致高水平的crizotinib耐藥。

通過對以上突變編碼的氨基酸被映射到ALK激酶區(qū)域晶體結(jié)構(gòu)的研究[15]，發(fā)現(xiàn)該系列突變出現(xiàn)在或者遠(yuǎn)離ATP和crizotinib的結(jié)合口袋區(qū)域的狹長凹陷處。2012 ASCO報道（Abstract No: 7504）Doebele等收集30例ALK陽性的經(jīng)crizotinib治療進(jìn)展后的NSCLC病例，19例取得活檢組織，15例可最終評價分子學(xué)指標(biāo)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)6例（40%）發(fā)生ALK激酶域繼發(fā)突變，并新發(fā)現(xiàn)了F1174C和D1203N突變；2例（其中1例有耐藥突變）出現(xiàn)新的ALK基因拷貝數(shù)增益（copy number gain, CNG）；4例出現(xiàn)其它基因位點(diǎn)的突變（1例EGFR突變；3例KRAS突變），伴或不伴ALK基因融合；1例腫瘤進(jìn)展的樣本缺乏ALK融合基因；3例ALK陽性樣本沒有明確的耐藥機(jī)制。該研究進(jìn)一步證明了耐藥機(jī)制發(fā)生的復(fù)雜性和臨床治療克服耐藥面臨的諸多挑戰(zhàn)[16]。

隨著研究的擴(kuò)展和深入，更多的ALK融合基因的繼發(fā)突變被發(fā)現(xiàn)。在NSCLC中ALK融合基因的發(fā)生率較低，并且還分為多種亞型，這給臨床檢測鑒定帶來了困難。不同亞型與繼發(fā)突變之間有何相關(guān)性，多個繼發(fā)突變位點(diǎn)之間又有什么聯(lián)系，很多問題有待深入研究。尤其是對于中國的患者，尚需精確檢測并大規(guī)模的分析ALK融合的發(fā)生率和不同ALK融合基因亞型的發(fā)生頻率及其與EGFR等其它分子靶點(diǎn)之間的關(guān)系。

2 信號傳導(dǎo)旁路的激活

ALK是一個高度保守的受體酪氨酸激酶（receptor tyrosine kinase, RTK），作為核磷蛋白（nucleophosmin,NPM）融合物，在1994年首次在間變性大細(xì)胞淋巴瘤（Anaplastic Large Cell Lymphoma, ALCL）中發(fā)現(xiàn)[17]。ALK有三個結(jié)構(gòu)域：胞外配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域，跨膜區(qū)和胞內(nèi)酪氨酸激酶域。就同源性來說，ALK與白細(xì)胞酪氨酸激酶（leukocyte tyrosine kinase, LTK）是最相似的，都屬于胰島素受體超家族。在生理條件下結(jié)合配體誘導(dǎo)的ALK二聚體可導(dǎo)致反式磷酸化和激酶的活化[18]。此外，不同于原來的ALK定位于質(zhì)膜，ALK融合蛋白的大部分分布到細(xì)胞質(zhì)中，這種在細(xì)胞定位上的不同可能導(dǎo)致ALK激活機(jī)制的改變。

ALK的關(guān)鍵下游效應(yīng)信號比上游信號的激活更為人們所了解，包括Ras/MEK/ERK、PI3K/AKT和JAK3-STAT3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[19,20]。在一般情況下，Ras/MEK/ERK是重要的細(xì)胞增殖信號傳導(dǎo)通路，而PI3K/AKT和JAK3-STAT3通路對于細(xì)胞存活和細(xì)胞骨架的變化是很重要的。藥理學(xué)抑制就是通過使用EML4-ALK TKI使Ras/MEK/ERK和PI3K/AKT通路分子表達(dá)下調(diào)，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[21]。小分子TKI crizotinib（PF02341066）作為一種強(qiáng)效的ALK抑制劑[22]，與NPM-ALK陽性的ALCL細(xì)胞G1-S期的細(xì)胞周期阻滯相關(guān)，抑制ALK磷酸化和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。在細(xì)胞和轉(zhuǎn)基因小鼠模型的體內(nèi)外研究中，EML4-ALK是一種強(qiáng)效致癌的“驅(qū)動突變”[21,23]。含有這種基因重組的癌細(xì)胞變得依賴或“沉溺”于ALK，對ALK激酶抑制是高度敏感的[24]。然而，在ALK抑制劑耐藥模型中，即使持續(xù)使用酪氨酸激酶抑制劑，Ras/MEK/ERK以及PI3K/AKT傳導(dǎo)通路仍都被再次激活[18]。即ALK下游信號傳導(dǎo)旁路的激活會繞過抑制劑作用的原始靶點(diǎn)，成為ALK抑制劑耐藥性產(chǎn)生的原因之一[25]。

在2012 ASCO的教育專場中，Camidge也指出ALK TKI的耐藥機(jī)制可能包括其它旁路途徑的活化，如EGFR、KIT受體的活化。可見，ALK TKI的耐藥機(jī)制是多樣化的，需要積累樣本開展大規(guī)模的綜合分析，為最終克服耐藥提供方法和數(shù)據(jù)。

Takezawa等[26]為了研究EML4-ALK致癌的功能，建立了非轉(zhuǎn)化的小鼠成纖維細(xì)胞系（NIH 3T3）。這些細(xì)胞可以穩(wěn)定表達(dá)EML4-ALK的亞型1或3（3T3/EAV1和3T3/EAV3細(xì)胞）。研究中發(fā)現(xiàn)，與3T3-模擬細(xì)胞相比，3T3/EAV1和3T3/EAV3細(xì)胞表達(dá)磷酸化的ERK和STAT3水平都明顯增加，而EML4-ALK的表達(dá)并不影響3T3-模擬細(xì)胞AKT的磷酸化水平。他們對3T3/EAV1和3T3/EAV3細(xì)胞使用ALK的siRNA進(jìn)行EML4-ALK RNA干擾（RNA interference, RNAi），明顯抑制ERK和STAT3的磷酸化，但對AKT無明顯影響。這些數(shù)據(jù)表明，EML4-ALK亞型1或3可以激活ERK和STAT3信號通路，而不是PI3K/AKT信號傳導(dǎo)通路。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，在所有3種細(xì)胞系中新型酪氨酸激酶抑制劑TAE684抑制ERK和STAT3的激活，同樣不影響AKT。這表明ALK抑制劑誘導(dǎo)EML4-ALK陽性肺癌細(xì)胞的生長抑制和凋亡，伴隨這些影響的不是PI3K/AKT信號通路而是ERK及STAT3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。ALK抑制劑可以明顯抑制ERK及STAT3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，PI3K/AKT信號通路則可能不受影響或者影響較小，可以繼續(xù)傳遞信號，成為耐藥性產(chǎn)生的原因之一。

最近的研究[19]表明，sonic hedgehog信號傳導(dǎo)通路（SHH/GLI1）也在ALK陽性ALCL內(nèi)被激活。SHH/GLI1是由于SHH基因擴(kuò)增，其實是NPM-ALK基因通過激活PI3K/AKT信號通路進(jìn)一步介導(dǎo)該通路并產(chǎn)生穩(wěn)定的GLI1蛋白。這一AKT旁路的激活也可能是導(dǎo)致耐藥性的原因。

Katayama等[27]培育的H3122 CR3細(xì)胞對ALK抑制劑和HSP90抑制劑均耐藥。Crizotinib作用于該細(xì)胞系后，其抑制磷酸化ALK的水平與敏感性親代細(xì)胞程度相同。然而，盡管受ALK抑制，AKT和ERK仍保持活化。這表明AKT和ERK信號傳導(dǎo)途徑的活化是由ALK以外的調(diào)節(jié)器維持的。磷酸化受體酪氨酸激酶微列陣分析表明，H3122 CR3細(xì)胞與親代細(xì)胞相比，在crizotinib治療前后都含有更高水平的磷酸化EGFR和磷酸化ERBB3。另外，Real Time RT-PCR分析表明，在耐藥細(xì)胞中，EGFR mRNA、EGFR配體雙調(diào)蛋白和ERBB3配體NRG1有所上調(diào)，推測H3122 CR3細(xì)胞內(nèi)EGFR活化可能是由于上調(diào)受體本身以及兩個配體導(dǎo)致持久性ALK非依賴的下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的活化。

Sasaki等[6]的研究同時表明，EGFR信號通路的激活作為旁路的信號傳導(dǎo)機(jī)制，也導(dǎo)致ALK抑制劑耐藥，同時抑制EGFR和ALK的方法對所有耐藥模型的治療有效。

上述研究結(jié)果提示我們?yōu)榱丝朔rizotinib耐藥，可以將其與其它的信號通路抑制劑聯(lián)合使用（如培美曲塞、EGFR抑制劑或HSP90抑制劑），或者與其它的ALK抑制劑聯(lián)合使用。

3 ALK融合基因拷貝數(shù)目增益

拷貝數(shù)目的增益定義為與預(yù)處理樣本相比，治療后樣本每個細(xì)胞內(nèi)重組基因數(shù)目有2倍以上的增加。最近的研究[27]表明ALK融合基因拷貝數(shù)目的增益與crizotinib耐藥性相關(guān)。通過熒光原位雜交技術(shù)（f l uorescent in situ hybridization, FISH）可以檢測crizotinib治療前后每個細(xì)胞基因重組ALK拷貝的含量[28]。在評估的90例樣本中30例接受了crizotinib治療，檢測結(jié)果表明ALK陽性細(xì)胞有更高的拷貝數(shù)（r=0.743, P＜0.000,1）。在ALK陽性的腫瘤中，陽性細(xì)胞的百分比和拷貝數(shù)都是預(yù)測ALK抑制劑的治療作用的有效指標(biāo)。Katayama等[14]報道了18例獲得crizotinib耐藥的肺癌患者中有1/4伴有ALK融合基因的擴(kuò)增，而且在發(fā)生耐藥的患者中多種耐藥機(jī)制并存。Doebele等[13]的研究中有2例患者（18 %）出現(xiàn)明顯的ALK重組基因增益。這些結(jié)果都表明，ALK融合基因的大量擴(kuò)增可能導(dǎo)致ALK抑制劑耐藥性的產(chǎn)生。

4 其它機(jī)制

在Doebele等[13]的研究中還有2例患者顯示為KRAS基因突變，其中1例并沒有明顯的證據(jù)表明其含有永久性的ALK基因重組；1例患者與基線樣本相比變?yōu)锳LK融合基因陰性，沒有明確的啟動機(jī)制；2例患者始終保持ALK陽性，但沒有明確其耐藥機(jī)制。因此考慮獨(dú)立致癌驅(qū)動因子等因素與耐藥性的產(chǎn)生有關(guān)。綜上所述，ALK-TKI分子靶向治療不可避免的產(chǎn)生耐藥問題，使得其對患者的治療療效逐漸降低。其耐藥機(jī)制復(fù)雜，主要包括：①ALK激酶區(qū)域的二次突變（不同的突變基因?qū)е碌哪退帣C(jī)制還有所不同，進(jìn)一步的多元耐藥機(jī)制還需要深層的研究）；②信號傳導(dǎo)旁路的激活，使得信號傳導(dǎo)繞過抑制劑作用的原始靶點(diǎn)，產(chǎn)生耐藥性；③ALK融合基因增益；④產(chǎn)生非依賴性的致癌因子等機(jī)制都與其耐藥性相關(guān)。有很多機(jī)制還處于未知狀態(tài)，有待于進(jìn)一步的研究。目前已知的ALK抑制劑發(fā)生耐藥的幾種機(jī)制見圖1。

5 ALK抑制劑在其它腫瘤治療中的應(yīng)用

ALK基因異常主要發(fā)生在間變性大細(xì)胞淋巴瘤、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、炎性肌纖維母細(xì)胞瘤和NSCLC中。在一個由多中心兒童腫瘤組織開展的I期臨床試驗中，參與的兒童通過服用crizotinib獲得了緩解，而且副作用很小。2012 ASCO報道了這項研究發(fā)現(xiàn)。8例患有ALCL的兒童中，有7例完全緩解；7例有ALK基因易位的IMT患者，1例微效，1例部分緩解；35例神經(jīng)母細(xì)胞瘤患者，27例可評價療效。8/27例患者有ALK基因突變：1例治療后完全緩解并維持超過6個月，1例微效。2例病變穩(wěn)定超過8個療程。1例NSCLC患者部分緩解。Butrynski等[8]報道1例ALK易位的IMT患者對crizotinib部分反應(yīng)?；颊呓邮躢rizotinib治療8個月后無疾病進(jìn)展，腫瘤切除術(shù)后19個月無復(fù)發(fā)。Lennerz等[29]報道2例Met擴(kuò)增胃食管癌患者對crizotinib敏感。治療后腫瘤縮?。?30%和-16%）并持續(xù)了3.7個月和3.5個月。Gambacorti-Passerini等[30]報道2例復(fù)發(fā)的ALK陽性ALCL患者crizotinib治療后1周顯示了臨床改善，完全應(yīng)答分別持續(xù)了6個月和15個月。

ALK抑制劑在其它腫瘤中的耐藥機(jī)制報道較少。Sasaki等[9]報道攜帶RANBP2-ALK易位的IMT患者使用crizotinib治療后疾病進(jìn)展是由ALK的F1174L突變所致。一個神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系SK-N-SH，在ALK基因中含有F1174L突變，在用TAE684處理后發(fā)生耐藥伴隨STAT3磷酸化水平升高[31]。這也提示NSCLC中發(fā)生ALK抑制劑耐藥的復(fù)雜性和特殊性。

6 發(fā)展前景

圖1 ALK抑制劑在非小細(xì)胞肺癌中發(fā)生耐藥的不同機(jī)制Fig1 Multiple mechanisms of resistance to ALK inhibitors in non-small cell lung cancer (NSCLC)

在了解有關(guān)的耐藥機(jī)制后最關(guān)注的是如何根據(jù)不同的耐藥機(jī)制克服耐藥問題。Katayama等[27]證實另一種強(qiáng)效ALK抑制劑AP26113，可以克服crizotinib耐藥。而Li等[32]在研究中也使用了一個強(qiáng)效有力并且有選擇性的ALK小分子抑制劑-NPV-TAE684，以評估EML4-ALK在NSCLC中的致癌作用。他們的實驗結(jié)果表明TAE684可以在EML4-ALK融合基因陽性的NSCLC模型中抑制細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯、凋亡和腫瘤消退。他們用微陣列分析方法，有針對性地開展對TAE684治療后H2228 NSCLC移植瘤模型基因表達(dá)途徑變化的研究，并確定了EML4-ALK抑制的基因印記（基因印記表示1210已知的人類基因，以及最佳的生物過程表代表這些基因的細(xì)胞周期、DNA合成、細(xì)胞增殖和細(xì)胞死亡）。他們還比較了TAE684和crizotinib的療效，雖然crizotinib能夠減少H2228和H3122細(xì)胞的生存率，但與TAE684相比不太有效：H2228和H3122相對的crizotinib IC50值分別為871 nmol/L和1,551 nmol/L，而TAE684對應(yīng)的IC50值為16 nmol/L（H2228）和44 nmol/L（H3122）。證明了TAE684是一個更有力的EML4-ALK抑制劑，在crizotinib耐藥性NSCLC的治療中可能取得更好的療效，在克服耐藥的實驗研究進(jìn)程中起重要的作用。

2012年歐洲腫瘤內(nèi)科學(xué)會報道了一些新的ALK抑制劑的研發(fā)，對crizotinib無效的患者也有活性。一項小樣本的研究結(jié)果（Abstract No: 440_O）探討了LDK治療56例ALK陽性的腫瘤患者的療效。在接受crizotinb治療后疾病進(jìn)展的患者中，這個藥物療效明顯；另一個ALK抑制劑CH5424802[33]也對ALK陽性的NSCLC患者顯示出有臨床意義的抗腫瘤活性(Abstract No: 441_O)；此外，HSP90抑制劑也代表一種新型的治療策略[34,35]。其中AUY922對crizotinb治療后疾病進(jìn)展的患者或EGFR抑制劑（吉非替尼或厄洛替尼）治療后進(jìn)展的EGFR陽性患者均有治療作用(Abstract No: 438_O)。一種HSP90抑制劑17-烯丙基氨基-17-去甲氧基格爾德霉素（17-AAG）能夠抑制四種突變形式的EML4-ALK，類似于其對野生型EML4-ALK的效力。17-AAG降低表達(dá)野生型或突變型EML4-ALK的Ba/F3細(xì)胞株的磷酸化ALK和所有ALK蛋白的表達(dá)，克服crizotinib耐藥介導(dǎo)的二次ALK突變，尤其是像1151Tins這類經(jīng)檢測對所有ALK抑制劑高水平耐藥的突變[27]。

已經(jīng)發(fā)現(xiàn)ALK的二次突變可同時伴有EGFR突變，說明crizotinib耐藥可能同時由多種耐藥機(jī)制共同誘導(dǎo)。因此，融合性的二代新型抗腫瘤藥物的研發(fā)也勢在必行。對于EGFR TKI耐藥的研究也給出很多啟示，采取全身治療（原靶向治療藥物、新靶向治療藥物和細(xì)胞毒性藥物等）和局部治療（手術(shù)、放療和各種介入治療）的聯(lián)合以克服耐藥性，從而盡可能有效的治療癌癥。此外，多靶點(diǎn)酪氨酸激酶抑制劑可以多途徑干擾腫瘤細(xì)胞的發(fā)生和發(fā)展，為TKI耐藥患者帶來福音。但目前大部分多靶點(diǎn)酪氨酸激酶抑制劑仍處于臨床試驗階段，其最佳適用人群尚需進(jìn)一步研究。

已經(jīng)進(jìn)行的第一項crizotinib的III期臨床研究（PROFILE 1007）顯示crizotinib帶來的改善是非常明顯的，疾病進(jìn)展風(fēng)險降低50%。在歡欣鼓舞的同時更加迫切的需要解決目前存在的諸多問題。ALK抑制劑發(fā)生耐藥性的頻率，不同耐藥機(jī)制的發(fā)生頻率，各種耐藥機(jī)制之間的相互作用關(guān)系，以及ALK抑制劑耐藥與其他TKI之間的關(guān)系尚待研究。Heuckmann等[36]已證明不同的ALK融合基因和EML4-ALK亞型對crizotinib和TAE684的敏感性不同，其機(jī)制與蛋白表達(dá)的穩(wěn)定性相關(guān)。有趣的是，它們對HSP90抑制的敏感性也不同，而且這種不同與它們對ALK抑制劑的敏感性也是有差異的。二者合用效果更佳。這些結(jié)果提示需要精確檢測ALK的基因型并探討研究ALK抑制劑的組合應(yīng)用策略。此外，多種突變共存的患者是否可以使用融合性新型抗腫瘤藥物治療，單藥應(yīng)用時通過藥物假期和再次給藥的方式能否有效的克服耐藥，新研制開發(fā)的藥物在已經(jīng)發(fā)生耐藥的患者中的治療效果和安全性等問題還有待實踐驗證。