肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)敏感非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞對(duì)吉非替尼耐藥及機(jī)制的研究

玄香蘭 安昌善 周彩存

吉非替尼是一種選擇性表皮生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶抑制劑（epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor, EGFR-TKI），是目前最常用的治療非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）分子靶向藥物。由于吉非替尼對(duì)患者的選擇性，僅部分NSCLC患者對(duì)吉非替尼有效，存在原發(fā)或獲得耐藥，這種耐藥機(jī)制不十分清楚。c-Met是肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（hepatocyte growth factor, HGF）的受體，新近研究[1]顯示，肺癌組織中MET基因的擴(kuò)增與對(duì)吉非替尼獲得性耐藥有關(guān)。本研究選擇NSCLC細(xì)胞EGFR突變型PC-9和EGFR野生型H292，用HGF誘導(dǎo)這兩株細(xì)胞，應(yīng)用MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖、周期及凋亡，利用蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞中c-Met、p-Met的表達(dá)，旨在研究HGF誘導(dǎo)不同基因型NSCLC對(duì)吉非替尼耐藥及耐藥機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 人肺癌細(xì)胞株P(guān)C-9、H292由上海肺科醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室凍存提供；HGF購(gòu)自以色列PROSPEC公司，吉非替尼購(gòu)自武義金色年華藥物研發(fā)公司，Annexin V-PE Apoptosis Detection Kit為BioVision公司產(chǎn)品，F(xiàn)low Cytometry Analysis of Cell Kit為上海杰美基因醫(yī)藥有限公司產(chǎn)品，鼠抗人p-EGFR（Tyr1068）、兔抗人p-Met（Tyr1234/1235）及c-Met購(gòu)自Cell Signaling Technology公司，小鼠抗人β-actin單抗及辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔、羊抗小鼠IgG抗體為武漢博士德產(chǎn)品。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及藥物配制 將存有PC-9和H292的液氮凍存管迅速放入37oC恒溫水浴箱快速融化，PBS洗滌后加入10 mL含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，5%CO2、37oC恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育，每3-4天換液傳代。HGF 10 μg加入100 μL無(wú)菌雙離子水稀釋成100 μg/mL的母液。吉非替尼原料用DMSO溶解稀釋成濃度為50 μmol/mL的母液，用藥時(shí)DMSO終濃度要小于0.1%。

1.3 測(cè)定細(xì)胞活性及藥物半數(shù)抑制濃度（IC50） 取100 μL含細(xì)胞數(shù)為5×103個(gè)的細(xì)胞懸液接種于96孔板。待細(xì)胞貼壁后加入100 μL含有HGF或（和）不同濃度吉非替尼的培養(yǎng)液。72 h后每孔內(nèi)加入20 μL MTT（5 mg/mL），孵育4 h，離心，棄上清液，每孔加入200 μL DMSO，搖床上充分混勻1 h，待結(jié)晶完全溶解。最后用酶標(biāo)儀測(cè)量波長(zhǎng)530 nm時(shí)OD值；細(xì)胞存活率=（每組平均OD值-試劑空白/對(duì)照組平均OD值-試劑空白）×100%；實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，用細(xì)胞存活率做出量效曲線，用作圖法分析得出兩種藥物對(duì)不同細(xì)胞的IC50。

1.4 細(xì)胞周期的檢測(cè) 取1×105個(gè)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種于6孔板，貼壁后棄原培養(yǎng)液，用PBS清洗2遍，加入含有HGF或（和）吉非替尼培養(yǎng)液，培養(yǎng)48 h，胰酶消化并收集全部細(xì)胞，離心去上清液，冷PBS洗滌2次，加1 mL固定液，固定2 h以上。離心去上清液，冷PBS洗滌2次, 加入500 μL標(biāo)記液（500 μL Assay Buffer+10 μL RNase A+10 μL PI），避光、室溫孵育30 min，過(guò)濾后流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期，用Multicycler 3.0軟件分析結(jié)果。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 細(xì)胞凋亡的檢測(cè) 取1×105個(gè)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種于6孔板，貼壁后棄原培養(yǎng)液，用PBS清洗2遍，加入含有HGF或（和）吉非替尼培養(yǎng)液，培養(yǎng)48 h和72 h，胰酶消化并收集全部細(xì)胞，離心去上清液，冷PBS洗滌2次。加入500 μL Binding Buffer懸浮細(xì)胞，加入5 μL Annexin V-PE混勻，避光、室溫反應(yīng)5 min，過(guò)濾后流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 Western blot檢測(cè)細(xì)胞蛋白 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的細(xì)胞，給予相應(yīng)處理后立即冰上裂解細(xì)胞，4oC、12,000 rpm、30 min、離心收集各組蛋白裂解液。用BCA蛋白定量法蛋白定量。取30 μg-40 μg蛋白經(jīng)8%-10%SDS-PAGE電泳分離后，轉(zhuǎn)印至NC膜上，用5%脫脂奶粉封閉1 h，一抗孵育4oC過(guò)夜，TBST洗膜10 min、3次后二抗室溫?fù)u床孵育1 h，TBST洗膜5 min、5次后ECL化學(xué)發(fā)光試劑顯色、曝光成像。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 數(shù)值以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差來(lái)表示，采用SPSS 11.5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。以配對(duì)t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 吉非替尼或/和HGF處理的藥物濃度-生長(zhǎng)曲線 吉非替尼對(duì)PC-9和H292的IC50分別為（0.05±0.01）μmol/L和（0.17±0.05）μmol/L。隨著吉非替尼濃度的升高，72 h內(nèi)細(xì)胞存活率減少，即吉非替尼對(duì)PC-9和H292的生長(zhǎng)抑制作用呈濃度依賴性，藥物濃度越高細(xì)胞存活率越低（圖1）。當(dāng)PC-9和H292用HGF（40 ng/mL）和不同濃度吉非替尼同時(shí)處理時(shí)，其藥物濃度-生長(zhǎng)曲線往右移（圖1）。當(dāng)用HGF（40 ng/mL）和不同濃度吉非替尼同時(shí)處理時(shí)，吉非替尼對(duì)PC-9和H292的IC50值均大于1 μmol/L，而且估計(jì)H292的IC50遠(yuǎn)大于1 μmol/L。

2.2 不同濃度HGF誘導(dǎo)PC-9和H292對(duì)吉非替尼耐藥 實(shí)驗(yàn)共分4組：對(duì)照組（C）、HGF誘導(dǎo)組（H）、吉非替尼處理組（G）、HGF誘導(dǎo)和吉非替尼處理組（HG）。PC-9和H292先用HGF（40 ng/mL）誘導(dǎo)24 h后再用吉非替尼處理72 h，結(jié)果與G組存活率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），而同時(shí)用HGF和吉非替尼處理組與單純用吉非替尼處理組細(xì)胞存活率更高，兩組間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）（圖2）。所以上述藥物濃度-存活率以及接下來(lái)的實(shí)驗(yàn)均采用HGF和吉非替尼同時(shí)加入的方法來(lái)處理。HGF（40 ng/mL）并沒(méi)有影響肺癌細(xì)胞PC-9和H292的增殖，但HGF能誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞對(duì)吉非替尼耐藥，G組和HG組的存活率有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）（圖3）。用低濃度HGF（20 ng/mL）處理沒(méi)有影響PC-9和H292的增殖，但低濃度HGF也能誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞對(duì)吉非替尼耐藥，G組和HG組的存活率有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）（圖3）。

圖1 吉非替尼或/和HGF處理的濃度-存活率曲線（HGF誘導(dǎo)時(shí)曲線往右移）Fig1 The concentration-survival curve when treating with gefitinib or/and HGF (curve shifts right when induced by HGF)

圖2 HGF（40 ng/mL）誘導(dǎo)不同時(shí)間（0 h、24 h）后吉非替尼（1 μmol/L）處理對(duì)肺癌細(xì)胞PC-9和H292存活率的影響。C：對(duì)照組；H：HGF誘導(dǎo)組；G：吉非替尼處理組；HG：HGF誘導(dǎo)和吉非替尼處理組。▽:與吉非替尼處理組（G）相比，P＜0.05。Fig2 The effects of cells survival when treating with gefitinib after induced by HG (40 ng/mL) in different time (0 h, 24 h). C: control group; H: HGF group; G: gefitinib group; HG: HGF+gefitinb group. ▽: compared with the G group, P＜0.05.

2.3 HGF誘導(dǎo)吉非替尼耐藥對(duì)細(xì)胞凋亡的影響 光鏡下觀察，吉非替尼能明顯促進(jìn)PC-9凋亡，而吉非替尼對(duì)促進(jìn)H292的凋亡作用并不明顯。因此我們只選擇凋亡作用明顯的PC-9來(lái)說(shuō)明凋亡在HGF誘導(dǎo)吉非替尼耐藥過(guò)程中的影響。根據(jù)MTT檢測(cè)的陽(yáng)性結(jié)果選擇不同濃度HGF（20 ng/mL、40 ng/mL）及吉非替尼（0.1 μmol/L）不同時(shí)間（48 h、72 h）處理PC-9。結(jié)果HG組凋亡率與G組相比有減少趨勢(shì)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）（圖4）。

2.4 HGF誘導(dǎo)吉非替尼耐藥對(duì)細(xì)胞周期的影響 PC-9和H292經(jīng)HGF（20 ng/mL）或/和吉非替尼（0.1 μmol/L）各處理48 h。吉非替尼明顯增加PC-9的G1期細(xì)胞比例，但G組與HG組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。吉非替尼略增加H292的G1期細(xì)胞比例，但與HG組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）（圖5）。

2.5 HGF激活c-Met磷酸化 為了明確HGF誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞對(duì)吉非替尼耐藥機(jī)制，應(yīng)用Western blot檢測(cè)c-Met和p-Met表達(dá)。HGF作用能明顯刺激PC-9和H292中c-Met的自身磷酸化（圖6）。PC-9為EGFR突變株，對(duì)吉非替尼十分敏感，吉非替尼對(duì)PC-9的IC50值為0.05 μmol/L。PC-9的HG組c-Met的磷酸化表達(dá)不明顯，但與G組相比c-Met的磷酸化表達(dá)稍有增加（圖6）。H292為EGFR野生株，但對(duì)吉非替尼敏感，吉非替尼對(duì)H292的IC50值為0.17 μmol/L。HG組以及H組c-Met的磷酸化均明顯增加，H292的HG組與G組相比c-Met的磷酸化明顯增加（圖6）。

圖3 HGF（20 ng/mL、40 ng/mL）或/和吉非替尼對(duì)肺癌細(xì)胞存活率的影響。▽?zhuān)号c吉非替尼處理組（G）相比，P＜0.05。Fig3 The effects of cells survival when treated with gefitinib or/and HGF (20 ng/mL, 40 ng/mL). ▽: compared with the G group, P＜0.05.

圖4 HGF誘導(dǎo)耐藥對(duì)細(xì)胞凋亡的影響Fig4 The effects of apoptosis in gefitinib resistence induced by HGF

圖5 HGF誘導(dǎo)耐藥對(duì)細(xì)胞周期的影響。G0/G1：DNA復(fù)制前期；S：DNA復(fù)制期；G2/M：DNA分裂期。Fig5 The effects of cell cycle in gefitinib residence induced by HGF. G0/G1: prophase of DNA; S: replicative phase of DNA;G2/M: mitotic phase of DNA.

圖6 HGF誘導(dǎo)PC-9和H292細(xì)胞c-Met及p-Met表達(dá)Fig6 Expression of c-Met and p-Met in PC-9 and H292 induced by HGF

3 討論

EGFR-TKIs對(duì)NSCLC患者有效率約為10%-20%[2]，也就是說(shuō)80%-90%的NSCLC患者對(duì)EGFR-TKIs耐藥。EGFR突變與EGFR-TKIs有效率有很大的相關(guān)性，但突變患者中70%-75%有效[3]，而25%～30%突變者則無(wú)效。NSCLC的野生型患者有10%～15%的有效率，野生型者中有85%-90%是耐藥患者[4]。NSCLC患者存在原發(fā)性或獲得性對(duì)EGFRTKIs耐藥，其耐藥機(jī)理尚未完全明確，EGFR的二次突變與MET基因的擴(kuò)增被認(rèn)為是吉非替尼獲得性耐藥的重要機(jī)制。HGF屬于成纖維細(xì)胞的衍生因子，惡性腫瘤患者血清中HGF含量明顯升高，與腫瘤的侵襲狀態(tài)密切相關(guān)[5]。HGF與特異性c-Met受體結(jié)合而發(fā)揮作用，促進(jìn)多種組織細(xì)胞增生分裂、促細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和促血管生成[6]。

我們選擇對(duì)吉非替尼敏感的EGFR突變肺腺癌細(xì)胞型PC-9和EGFR野生型H292，這兩株細(xì)胞不存在EGFRT790M突變或MET擴(kuò)增或KRAS突變等吉非替尼耐藥相關(guān)因素。本研究細(xì)胞活性檢測(cè)顯示HGF單獨(dú)沒(méi)有促進(jìn)細(xì)胞增殖，但HGF誘導(dǎo)與非HGF誘導(dǎo)的藥物濃度-存活率曲線相比，HGF誘導(dǎo)的藥物濃度-存活率曲線明顯往右移，提示HGF誘導(dǎo)細(xì)胞存活。PC-9和H292的HG組比G組均有更高的存活率（P＜0.05）。從IC50的變化、藥物濃度-存活率曲線、細(xì)胞存活率的結(jié)果看出，HGF不僅誘導(dǎo)敏感肺癌細(xì)胞對(duì)吉非替尼耐藥，而且與EGFR突變型和野生型無(wú)關(guān)。在HGF和吉非替尼用濃度相同處理下，耐藥影響在EGFR野生型中的表現(xiàn)更明顯，提示野生型細(xì)胞更容易受HGF的干擾。

本研究中HGF誘導(dǎo)的PC-9凋亡率并沒(méi)有比對(duì)照組減少，可忽略細(xì)胞凋亡作用在HGF誘導(dǎo)耐藥中的影響。HGF能明顯減少H292的G1期細(xì)胞比例，增加S期和G2期細(xì)胞比例。經(jīng)過(guò)吉非替尼處理的誘導(dǎo)組G1期細(xì)胞比例與非誘導(dǎo)組相比沒(méi)有差異，提示細(xì)胞周期的影響可能與HGF誘導(dǎo)耐藥無(wú)關(guān)。

腫瘤細(xì)胞除了表達(dá)EGFR外同時(shí)還表達(dá)其它含酪氨酸激酶活性的跨膜受體，稱(chēng)之為EGFR旁路TK信號(hào)，包括c-Met，它們所引導(dǎo)的信號(hào)通路常常重疊、功能上發(fā)生碰撞[7]。c-Met廣泛存在于多種正常組織細(xì)胞和體內(nèi)外惡性腫瘤細(xì)胞內(nèi)。正常情況下HGF/c-Met信號(hào)途徑參與胚胎發(fā)生，而異常的HGF/c-Met信號(hào)途徑與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)，特別是在促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移方面起重要作用[8]。在NSCLC患者中c-Met陽(yáng)性表達(dá)者比c-Met陰性表達(dá)者存活率低，HGF和c-Met共表達(dá)者比任何一種陽(yáng)性表達(dá)者或者兩種均陰性表達(dá)者相比存活率明顯降低[9]。

本實(shí)驗(yàn)顯示，HGF誘導(dǎo)組包括HG組和H組均增加表達(dá)c-Met的磷酸化。兩種細(xì)胞的HG組均比G組增加表達(dá)c-Met的磷酸化，這可能是HGF誘導(dǎo)敏感細(xì)胞對(duì)吉非替尼耐藥的機(jī)制。本研究中PC-9是EGFR突變株，HGF誘導(dǎo)的c-Met磷酸化被吉非替尼抑制；而H292是EGFR野生株，HGF誘導(dǎo)的c-Met磷酸化不被吉非替尼抑制。雖然在EGFR突變株，HGF誘導(dǎo)的c-Met的磷酸化被吉非替尼所抑制，但從EGFR野生株的表現(xiàn)中可以看出，HGF通過(guò)激活c-Met的磷酸化誘導(dǎo)敏感肺癌細(xì)胞對(duì)吉非替尼耐藥。EGFR和c-Met都擁有廣泛的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)，兩種受體介導(dǎo)的信號(hào)通路廣泛交錯(cuò)，分別依賴于EGFR和c-Met的細(xì)胞的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)。吉非替尼抑制HGF活化的c-Met的磷酸化在不同基因類(lèi)型細(xì)胞之間的表現(xiàn)不一致，這為臨床指導(dǎo)治療不同基因型耐藥NSCLC提供理論依據(jù)。

HGF雖然是本研究中介入的外源性生長(zhǎng)因子，但先前就有文獻(xiàn)[10]報(bào)道肺癌組織能夠高表達(dá)HGF。HGF以自分泌或旁分泌的方式作用于其受體c-Met[11]，HGF誘導(dǎo)NSCLC對(duì)吉非替尼耐藥可能屬于原發(fā)性耐藥。本實(shí)驗(yàn)提示少數(shù)EGFR突變患者及多數(shù)EGFR野生型患者對(duì)吉非替尼耐藥的可能原因是HGF誘導(dǎo)NSCLC細(xì)胞表達(dá)的c-Met發(fā)生磷酸化。HGF/c-Met系統(tǒng)介導(dǎo)NSCLC對(duì)吉非替尼的耐藥，如果聯(lián)合HGF/c-Met信號(hào)靶向治療可能有利于提高肺癌患者對(duì)吉非替尼的敏感性。