過氧化物酶在多孔磁性微球修飾電極上的直接電化學(xué)行為研究

譚向恩，賴國松，韓德艷，張海麗

(湖北師范學(xué)院 化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，湖北 黃石 435002)

過氧化物酶是由微生物或植物所產(chǎn)生的一類氧化還原酶，它們能催化很多反應(yīng)，并參與諸多不同類型的生理過程，如生物活化氧分子和生物合成細(xì)胞壁等。所以研究這一類型酶的直接電化學(xué)行為，不僅可以模擬生物體內(nèi)氧化還原系統(tǒng)，而且對理解，認(rèn)識，揭示其中的電子轉(zhuǎn)移機(jī)制具有重要意義[1～2]。但是由于酶分子比較大，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，氧化還原中心被包裹在蛋白質(zhì)的多肽鏈中，很難接近電極表面，同時(shí)蛋白質(zhì)很容易在固體電極表面失活[3]。因此，人們研究各種酶的固定化材料比如納米材料[4]，表面活性劑[5]等，為酶提供適宜的微環(huán)境。

近年來，由于一些多孔材料具有均勻的孔徑，大的比表面積，良好的生物兼容性和化學(xué)穩(wěn)定性而被廣泛的用于酶和蛋白質(zhì)的固定[6～7]。作為一種重要的納米材料，磁性納米粒子因其優(yōu)良的性質(zhì)近年來越來越得到廣泛關(guān)注，并先后在包括酶固定在內(nèi)的許多領(lǐng)域得到成功應(yīng)用[8]。殼聚糖具有許多優(yōu)良的性質(zhì)生物兼容性、低毒性、化學(xué)惰性和優(yōu)異的成膜能力，常在傳感器的制備中用作成膜材料[9]。本文按文獻(xiàn)[10]合成了一種多孔的殼聚糖磁性微球(PMMS)，并研究了過氧化物酶(POD)在修飾了多孔殼聚糖磁性微球的碳糊電極(CPE)上的直接電化學(xué)行為。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

殼聚糖(脫乙酰度≥90%)(深圳伯奧生命科技公司)；過氧化物酶(POD)(美國Sigma公司)；過氧化氫(H2O2，30%)，購于武漢華飛化學(xué)試劑公司，其準(zhǔn)確濃度通過高錳酸鉀滴定法得到；25% 戊二醛；0.1 mol·L-1的磷酸鹽緩沖溶液 (PBS) 通過Na2HPO4和NaH2PO4配制而成并用0.1 mol·L-1的NaOH或H3PO4溶液調(diào)節(jié)合適的pH值。0.10 mol·L-1KCl的5.0m mol·L-1K3Fe(CN)6/K4Fe(CN)6(1∶1) 溶液；其它試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水。CHI830B 型電化學(xué)工作站(上海辰華儀器公司)；三電極系統(tǒng)：飽和甘汞電極為參比電極，鉑電極為輔助電極，修飾電極為工作電極。

1.2 修飾電極的制備

將1.8∶1(m∶m)光譜純石墨粉和石蠟油在瑪瑙研缽中充分混勻，然后將此碳糊均勻地填入內(nèi)徑為2 mm的玻璃管中并與其中的銅棒壓緊，拋光紙磨平后制得CPE.稱10.0 mg多孔磁性高分子微球(PMMS)于2 mL含5%戊二醛溶液中，超聲分散一段時(shí)間后得到5.0 mg·mL-1的均勻分散液。移取5μL該分散液滴加到預(yù)處理好的碳糊電極表面，晾干后滴加8μL的POD溶液(8.0 mg·mL-1，溶于0.1 mol·L-1的pH 7.5 PBS中)。該電極在室溫下置于空氣中4h晾干即得到所需的修飾電極POD/PMMS/CPE.

2 結(jié)果與討論

2.1 修飾電極的電化學(xué)表征

電化學(xué)阻抗(EIS)能夠提供電極表面修飾過程中的阻抗變化等有用信息[11]。圖1為PMMS修飾電極(a)， POD/PMMS修飾電極(b)，裸電極(c)在含有0.1 mol·L-1KCl的5.0m mol·L-1K3Fe(CN)6/ K4Fe(CN)6(1∶1)溶液中記錄的交流阻抗的Nyquist圖。從圖中可以看出，PMMS修飾電極的RCT較裸電極有明顯減小，說明覆蓋在電極表面的微球能夠在一定程度上促進(jìn)[Fe(CN)63-/4-]探針與電極表間的電子傳遞；而與PMMS修飾電極相比，POD/PMMS修飾電極的阻抗明顯增加，說明POD已經(jīng)成功固定在電極表面。

2.2 過氧化物酶在修飾電極上的電化學(xué)行為

圖1 PMMS修飾電極(a)，POD/PMMS修飾電極(b)，裸電極(c)的交流阻抗圖譜

利用循環(huán)伏安法研究了POD/PMMS修飾電極的電化學(xué)行為。與裸電極(圖2a) 相比，POD修飾電極(圖2b)峰電流增大，說明POD有一定的電催化還原作用；PMMS修飾電極(圖2c)與裸電極(圖2a)相比，電流增加，說明PMMS覆蓋在裸電極表面，使電極表面積增大。POD/PMMS修飾電極(圖2d)與PMMS修飾電極(圖2c)相比，還原峰電流明顯增大。說明修飾在電極上的多孔磁性高分子微球能夠較好的吸附POD.此外，當(dāng)1.0m mol·L-1H2O2加入到該試驗(yàn)底液中時(shí)，POD/PMMS修飾電極的還原峰電流明顯增加(圖2e)，說明該修飾電極對H2O2具有良好的電催化還原作用。

2.3 pH值影響

利用循環(huán)伏安法考察PMMS/POD修飾碳糊電極上的伏安行為的影響因素。從pH 5.0到7.5安培電流隨著pH值的增大而增大，pH值超過7.5后電流反而減小。實(shí)驗(yàn)還表明，隨著溶液的pH值增大，H2O2的還原峰電位發(fā)生負(fù)移，表明此還原過程有質(zhì)子參與反應(yīng)，根據(jù)實(shí)驗(yàn)中峰電位與pH值的線性關(guān)系:Epc(V)= 0.1917-0.066pH知，此反應(yīng)為一電子一質(zhì)子過程[12]。此氧化還原反應(yīng)的機(jī)理可能為：

PMMS-POD-Fe(III) + e + H+→ PMMS-POD-Fe(II)H

PMMS-POD-Fe(II)H + 1/2 H2O2→ PMMS-POD-Fe(III)+ H2O

2.4 掃速影響

圖3為在掃速為20～200 mV·s-1范圍內(nèi)，H2O2在PMMS/POD修飾電極上的峰電流與掃速的平方根成較好線性關(guān)系。線性回歸方程為：ipc(10-5A) = 0.1323 + 0.5986v1/2(n=9)，相關(guān)系數(shù)R=0.9996.故H2O2在該修飾電極上的電催化還原反應(yīng)為擴(kuò)散控制過程。由公式Randles - Sevcik equation：ip=2.69 ×105n3/2D1/2v1/2Ac 計(jì)算出擴(kuò)散系數(shù)D為5.03×10-10cm2·s-1.

2.5 安培響應(yīng)

圖3 不同掃速下POD/PMMS修飾電極在1.0 m mol·L-1H2O2底液中的循環(huán)伏安圖，內(nèi)插圖為峰電流與掃速的平方根間的線性關(guān)系。(掃速 v=20， 40， 60， 80， 120， 140，160， 180，200 mV s-1)

圖4為在-0.45V工作電位下，向緩沖溶液中(攪拌狀態(tài)下)連續(xù)滴加H2O2溶液，POD/PMMS修飾電極對H2O2的穩(wěn)態(tài)安培響應(yīng)圖。內(nèi)插圖為安培電流和H2O2濃度二者間的工作曲線。在0.1～0.8

3 結(jié)論

將POD酶在戊二醛交聯(lián)劑作用下固定于多孔磁性高分子微球修飾的碳糊電極的表面，由于多孔狀的結(jié)構(gòu)，不但增大了電極的表面積，吸附更多的POD酶，同時(shí)孔洞結(jié)構(gòu)使酶的氧化還原中心與電極表面更加接近，殼聚糖良好的生物兼容性很好的保持了酶的活性，為酶的提供了優(yōu)良的微環(huán)境，實(shí)現(xiàn)了酶在電極上的直接電化學(xué)，該修飾電極對H2O2有響應(yīng)，具有較好的選擇性、穩(wěn)定性和重現(xiàn)性。

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