產(chǎn)右旋糖酐酶埃氏交替單胞菌的篩選、鑒定及酶活分析

焦豫良，王淑軍，呂明生，房耀維，劉 姝

（1.淮海工學院海洋學院，江蘇連云港222005；2.江蘇省海洋資源開發(fā)研究院，江蘇連云港 222001）

右旋糖酐（dextran）是一種多由乳酸細菌，如腸膜狀明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）等合成的多糖。該多糖由α-D-吡喃葡萄糖基構成，至少50%的糖基通過α-1，6鍵連接成直鏈結構，其余部分由α-1，2、α-1，3或α-1，4鍵的分支糖基構成，α-1，6鍵比例越高則溶解性越好[1]。細菌、絲狀真菌、酵母等可產(chǎn)生右旋糖酐酶（dextranase，Dex；EC 3.2.1.11）水解細胞外的右旋糖酐生成單糖或低聚糖。右旋糖酐酶及其催化產(chǎn)物在食品工業(yè)中有重要而廣泛的應用。在工業(yè)制糖中，右旋糖酐酶可以降解糖液中的右旋糖酐，降低生產(chǎn)成本，提高得糖率和生產(chǎn)效率[1]。在功能食品中，右旋糖酐酶水解右旋糖酐產(chǎn)生的異麥芽寡糖（isomaltooligosaccharide，IMO）作為一種益生元能顯著提高腸道內有益微生物（如雙歧桿菌）群落數(shù)量，還可以治療持續(xù)性血液透析引起的便秘、高血脂等癥[2]。IMO作為動物飼料添加劑還可以增加養(yǎng)殖動物的免疫器官指數(shù)，提高生產(chǎn)性能[3]。目前商品化的右旋糖酐酶多為陸源真菌來源，如Novozyme公司生產(chǎn)的右旋糖酐酶來源于毛殼菌屬（Chaetomium erraticum）和青霉屬（Penicillium sp.）。海洋細菌來源的右旋糖酐酶產(chǎn)生菌報導較少，與陸源酶相比，海洋右旋糖酐酶具有更好的耐鹽、耐堿和耐低溫等性能，在食品工業(yè)中更具有應用前景。積極開發(fā)海洋右旋糖酐酶在工業(yè)和醫(yī)學中將有重要應用意義。埃氏交替單胞菌（Altermonas espejiana）為常見海洋細菌，是一種能運動、產(chǎn)氣、具有一個極鞭毛的革蘭氏陰性菌，該菌具有降解褐藻酸的活性，在海帶儲藏、運輸和加工中造成海帶的腐敗變質[4]。此外，該菌還可分泌胞外核酸酶和胞外α-淀粉酶，其發(fā)酵液的脂類提取物能誘導貝螅（Hydractinia echinata）的變態(tài)發(fā)育[5-7]。本實驗從海洋環(huán)境中篩選得到一株產(chǎn)右旋糖酐酶的埃氏交替單胞菌，并對產(chǎn)酶條件及右旋糖酐酶的性質進行研究。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

樣品來源 江蘇連云港港口潮間帶低潮線海泥；基本培養(yǎng)基 MgSO4·7H2O 0.02g，NaH2PO4·H2O 0.05g，CaCl2·2H2O 0.01g，K2HPO40.05g，蒸餾水100mL，pH8；分離培養(yǎng)基 在基本培養(yǎng)基中加入酵母粉1%，蛋白胨1%，右旋糖酐0.5%，藍色右旋糖酐2000 0.1%，pH8；產(chǎn)酶培養(yǎng)基 基本培養(yǎng)基中加入氯化鈉2%，右旋糖酐0.1%，纖維二糖0.5%，酵母粉0.5%，pH8；培養(yǎng)基、酶活測定、生理生化鑒定中所使用的試劑 購于國藥集團化學試劑有限公司；右旋糖酐T2000 美國Sigma公司；PCR反應和電泳試劑 上海生工生物工程有限公司；DNA 標準分子量DL2000，大連市波利盾生物工程有限公司。

SPX-250B-Z型生化培養(yǎng)箱 上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；SW-CJ-ICU超凈工作臺 蘇州安泰空氣技術有限公司；HZQ-F160全溫振蕩培養(yǎng)箱哈爾濱東聯(lián)電子技術開發(fā)有限公司；DK-8D型電熱恒溫水浴槽 上海醫(yī)用恒溫設備廠；PHS-2C型精密酸度計 上海精密科學儀器廠；DYCP-31A型瓊脂糖電泳儀 北京市六一儀器廠；5332型PCR儀 德國Eppendorf公司；MD24型透析袋 美國光譜醫(yī)藥公司，截留分子量50000；ELX808型酶標儀 美國Biotek公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌種篩選和鑒定 將海泥按1%加入液體分離培養(yǎng)基中，于30℃、150r/min搖床中進行搖瓶富集培養(yǎng)。培養(yǎng)基藍色褪去后，將培養(yǎng)液稀釋涂布在分離培養(yǎng)基固體平板上。對平板上形成透明圈的菌落再次純化。不需提取基因組DNA，直接對純化的菌落通過菌落PCR法擴增16S rRNA基因序列，正向引物27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，反向引物1492R：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’[8]。PCR擴增條件：94℃預變性2min，94℃變性30s、60℃退火45s、72℃延伸45s，34個循環(huán)，72℃終延伸7min。PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后由上海生物工程公司測序。所測得的16S rRNA基因序列與GenBank的數(shù)據(jù)庫中已有的序列進行Blast軟件分析，并提交到GenBank。利用Mega 5軟件基于16S rRNA基因序列對菌株進行系統(tǒng)進化分析，選擇NJ法構建系統(tǒng)發(fā)育樹[9]。對菌種進行革蘭氏染色和油鏡觀察，然后根據(jù)《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》進行生理生化反應實驗[10]。最終根據(jù)16S rRNA基因序列比對結果和生理生化反應確定菌株。

1.2.2 酶學性質研究 將菌株接入分離培養(yǎng)基，于30℃、150r/min搖床中培養(yǎng)24h。發(fā)酵液于10000r/min離心5min，收集上清液，以PBS緩沖液（pH8）為透析液，用透析袋MD24透析，4℃透析3h，隔1h換透析液一次。透析后的上清液為粗酶液，吸取100μL粗酶液加到1mL含1%右旋糖酐T2000的PBS緩沖液（pH8.0）中，在37℃水浴反應15min，用3，5-二硝基水楊酸（DNS）法測定還原糖量[11]。空白對照為相同成分的混合液，在反應前于沸水浴中加熱15min，后續(xù)操作相同。反應產(chǎn)物稀釋5倍，吸取150μL加入96孔板，酶標儀中讀取520nm處的吸光值。1個酶活力單位定義為30℃、pH8.0的條件下反應1min催化右旋糖酐產(chǎn)生1μmol異麥芽糖的酶量（U/mL）[12]。在10、20、25、30、35、40、50℃水浴和不同PBS緩沖液pH值6、6.5、7、7.5、8、8.5、9下測定該酶的活性，分析其最適反應溫度和pH值。在30、40、50℃水浴中，將粗酶液保溫2.5h，然后再測定其殘余酶活，研究其熱穩(wěn)定性。將粗酶液在30℃水浴中，pH值分別為6、6.5、7、7.5、8、8.5、9下保溫2、3、4h后測定酶活，分析其pH穩(wěn)定性。

1.2.3 產(chǎn)酶條件的確定

1.2.3.1 培養(yǎng)基碳源、氮源、NaCl濃度、初始pH值對產(chǎn)酶的影響 氮源實驗中，在基本培養(yǎng)基中加入0.5%硫酸銨，然后以0.5%的可溶性淀粉、葡萄糖、蔗糖、果糖、麥芽糖、纖維二糖、乳糖、右旋糖酐為不同碳源，考察常見的不同碳源對產(chǎn)酶的影響。

氮源實驗中，在基本培養(yǎng)基中加入0.5%纖維二糖，然后以0.5%的氯化銨、胰蛋白胨、酵母粉、蛋白胨、尿素、硫酸銨、硝酸鈉為不同氮源。培養(yǎng)液中接入2%的菌液（105CFU/mL），30℃下?lián)u床150r/min培養(yǎng)24h，測定酶活力。

在基本培養(yǎng)基中加入最佳碳源和氮源后，再加入不同濃度的NaCl（0%、2%、4%、6%、8%、10%、12%），按2%的接種量接種菌液（105CFU/mL），30℃下150r/min搖床中培養(yǎng)24h，測定酶活力。調節(jié)產(chǎn)酶培養(yǎng)基的初始pH值為4、5、6、7、8、9、10、11，接種2%的菌液（105CFU/mL），30℃下150r/min搖床中培養(yǎng)24h，測定酶活力。

1.2.3.2 培養(yǎng)時間和溫度對產(chǎn)酶的影響 將濃度為105CFU/mL的菌液按照2%的接種量接到產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，分別在0、4、15、20、25、28、30、35、40℃下，150r/min培養(yǎng)24h，測定酶活力，確定其最佳產(chǎn)酶溫度。在最佳產(chǎn)酶溫度（30℃）下150r/min搖床中培養(yǎng)72h，每隔4h取出1管培養(yǎng)物，離心取上清放4℃冰箱中保存，待全部培養(yǎng)時間結束一起測酶活力，確定其最佳產(chǎn)酶時間。每個樣品測三次，取平均值。由于上清液4℃冰箱中放置72h后，殘余相對酶活約為98.5%，遠小于培養(yǎng)時間對酶活的影響，因此在4℃冰箱中保存導致的酶活喪失可以忽略不計。

2 結果與分析

2.1 菌株的篩選和鑒定

本實驗篩選到一株產(chǎn)透明圈的菌株，編號為YSN412，菌落形態(tài)照片如圖1示。對該菌株進行16S rRNA基因序列擴增后測序，長度為1425bp，凝膠電泳情況如圖2所示。通過進行16S rRNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育分析，發(fā)現(xiàn)YSN412與交替單胞菌（Alteromonas）有較近的進化距離，系統(tǒng)發(fā)育樹如圖3示。油鏡觀察為桿狀革蘭氏陰性菌。生理生化反應實驗結果表明：菌落無色素，具有明膠液化能力，可以利用D-葡萄糖、蔗糖、乳糖、麥芽糖、D-果糖、纖維二糖、淀粉，不能利用甘油、水楊苷。根據(jù)《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》確定該菌株為交替單胞菌屬的埃氏交替單胞菌（A.espejiana）。A.espejiana YSN412菌株16S rRNA基因序列提交到GenBank，登錄號為JN622161。

圖1 A.espejiana YSN412菌株菌落形態(tài)Fig.1 Colony morphology of the A.espejiana YSN412 strain

圖2 A.espejiana YSN412菌株16S rRNA基因序列PCR擴增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳Fig.2 Agarose gel electrophoresis of the PCR product of the 16S rRNA gene of A.espejiana YSN412 strain

圖3 基于16S rRNA基因序列構建的A.espejiana YSN412菌株系統(tǒng)進化樹Fig.3 Phylogenic tree of A.espejiana YSN412 based on 16S rRNA gene sequences

2.2 酶學性質分析

A.espejiana YSN412菌株產(chǎn)的右旋糖酐酶（AesDEX）最適pH值為8（圖4-A），30℃下在pH6磷酸緩沖液中保溫4h后殘余酶活為52%，而在pH8緩沖液中保溫4h后，殘余酶活仍有96%（圖4-B）。AesDEX最適反應溫度為30℃（圖4-C），在30℃下保溫2.5h，相對酶活還在95%以上，但是在50℃保溫2.5h后只有14%的酶活力（圖4-D）。

圖4 溫度和pH對AesDEX酶活的影響Fig.4 Effect of pH and temperature on the enzymatic activity of AesDEX

2.3 產(chǎn)酶條件的分析

2.3.1 培養(yǎng)基碳源、氮源、NaCl濃度、初始pH值對產(chǎn)酶的影響 由圖5可知，纖維二糖最能促進A.espejiana YSN412菌株產(chǎn)酶，其次是淀粉、果糖、蔗糖，麥芽糖促進效果最差（圖5-A）。能促進產(chǎn)酶的最佳氮源是酵母粉，胰蛋白胨次之；無機氮源促進產(chǎn)酶的作用相對比較低（圖5-B）。培養(yǎng)基初始NaCl濃度為2%時，A.espejiana YSN412菌株產(chǎn)AesDEX酶活最高，在8%以后，呈現(xiàn)平穩(wěn)下降趨勢（圖5-C）。培養(yǎng)液初始pH為8時，菌株A.espejiana YSN412產(chǎn)酶能力最強（圖5-D）。碳源、氮源、培養(yǎng)基初始pH和NaCl濃度四個因素的研究中，各個成分的比較均以相對酶活表示，分別以纖維二糖、酵母粉、初始pH8、NaCl濃度為2%的條件下的酶活為1。

圖5 培養(yǎng)基成分對A.espejiana YSN412產(chǎn)酶影響Fig.5 Effect of medium composition on the enzyme production of A.espejiana YSN412

2.3.2 培養(yǎng)時間和溫度對產(chǎn)酶的影響 由圖6可知，A.espejiana YSN412菌株在12h的酶活力時最高，隨培養(yǎng)時間延長，酶活力逐漸降低（圖6-A）。在30℃下培養(yǎng)12h，培養(yǎng)液酶活力最高達到9U/mL，相對酶活達到100%（圖6-B）。圖6-B中各溫度下培養(yǎng)24h后的酶活為相對酶活，以30℃條件下的酶活為1。

3 結論與討論

右旋糖酐酶在食品工業(yè)中的應用廣泛。真菌來源右旋糖酐酶在甘蔗制糖工業(yè)中清除右旋糖酐方面有重要應用，這是由于其水解效率較高、熱穩(wěn)定性較好，最適作用溫度50℃左右，最適pH值接近5，適合在制糖工業(yè)中使用[1]。將淡紫色擬青霉（Paecilomyces lilacinus）產(chǎn)生的右旋糖酐酶添加入甘蔗汁中（0.15U/mL），可以清除73.3%的右旋糖酐[13]。另外，在食品安全中，應用右旋糖酐酶活性檢測便捷的特點，將其作為毒素的報告基因，如將微黃青霉來源的右旋糖酐酶轉入釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中，通過測定重組酵母右旋糖酐酶活性的丟失與否，用來鑒定待測樣品中是否存在真菌毒素[14]。

圖6 培養(yǎng)時間和溫度對A.espejiana YSN412產(chǎn)酶的影響Fig.6 Effect of culturing time and temperature on the enzyme production of A.espejiana YSN412

產(chǎn)右旋糖酐酶的海洋細菌報道較少，如交替假單胞菌（Pseudoaltermonas）可產(chǎn)生右旋糖酐酶，而目前尚未見交替單胞菌產(chǎn)右旋糖酐酶的報道[15]。本實驗中A.espejiana YSN412培養(yǎng)液酶活力（9U/mL）高于節(jié)桿菌屬（Arthrobacter）（約3U/mL），與真菌的發(fā)酵液酶活相近，如申氏孢子絲菌（Sporothrix schenckii）發(fā)酵液中酶活達到10.6U/mL[12，16]。該菌株的產(chǎn)酶峰值時間為12h，而通常細菌和真菌產(chǎn)酶峰值時間高于24h，在生產(chǎn)中具有降低成本、提高生產(chǎn)效率的優(yōu)勢。另外，該菌株產(chǎn)的右旋糖酐酶最適作用溫度為30℃，低于真菌右旋糖酐酶的最適作用溫度，在異麥芽寡糖的生產(chǎn)中具有降低生產(chǎn)成本的作用[17-18]。此外，該右旋糖酐酶最適作用溫度接近口腔溫度，還可以作為活性成分添加至漱口液等口腔護理產(chǎn)品中，通過降解牙菌斑中右旋糖酐，對菌斑的預防及治療起到一定的作用。

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