人乙酰肝素酶基因增強子的初步篩選與鑒定

陳曉鵬，楊來志，葛國朝，崔巍，屠佳，田野

(皖南醫(yī)學院弋磯山醫(yī)院肝膽一科，安徽蕪湖 241001)

乙酰肝素酶(也稱類肝素酶，heparanase，HPSE)是一種糖苷內切酶，它通過降解細胞外基質硫酸乙酰肝素蛋白多糖，在腫瘤轉移及血管生成等病理過中發(fā)揮重要作用，并在多數(shù)惡性腫瘤細胞高水平表達［1-2］。故深入研究HPSE基因的轉錄調控機制，對于合理調節(jié)其表達水平、探討腫瘤生物治療的新方法具有重要意義［3］。我們前期在克隆HPSE啟動子核心片段的基礎上分析發(fā)現(xiàn)，該啟動子雖可驅動下游基因在腫瘤細胞特異性表達，但活性較低［4-5］。本研究我們擬對HPSE基因啟動子上、下游鄰近序列進行分段擴增，并分別分析其促轉錄活性，為進一步篩選、鑒定其增強子序列奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 主要試劑、細胞和儀器

DL2000 DNA Marker、DL5000 DNA Marker、DL15000 DNA Marker、PFX、dNTP、PCR Buffers(Takara 公司);PCR純化試劑盒、DNA膠回收試劑盒(北京道普公司);無內毒素質粒大提試劑盒(北京天能生物技術有限公司);T4 DNA ligase、限制性內切酶KpnⅠ、SalⅠ、大腸桿菌DH5a感受態(tài)細胞、pEGFP-N1質粒和各種引物(上海生工生物公司合成);胰蛋白胨、酵母提取物、瓊脂(英國Oxoid公司);Lipofectamne 2000、DMEM培養(yǎng)基和RPIM-1640培養(yǎng)基(GIBCO公司)。人肝癌細胞BEL-7402、胃癌細胞SGC-7901(上海中科院細胞庫)。PCR擴增儀(BIORAD公司)，二氧化碳培養(yǎng)箱(Thermo Forma公司)，倒置顯微鏡(OLYMPUS公司);熒光顯微鏡(Nikon公司);FC500MPL流式細胞儀(Backman公司)。

1.2 候選序列的確定

根據HPSE之DNA序列，設計選取10個片段作為增強子候選序列(enhx，x分別為1，2……10)，其中啟動子上游6段，啟動子下游4段，每個片段共1 200 bp，為避免相鄰片段之間將增強子序列截為兩個部分，在兩相鄰片段之間重疊200 bp。

1.3 重組質粒的構建與鑒定

改造載體 PEGFP-N1中的 VspⅠ位點，增加KpnⅠ、SalⅠ酶切位點，退火引物為taatGGCGCGCCaa tcgaaGGTACCgacaaACGCGTatccgaGTCGACat和taatGTC GACtcggatACGCGTttgtcGGTACCttcgattGGCGCGCCat，改造的質粒命名為pEGFP-MU，作為本研究的陰性對照載體?；瘜W方法合成猿猴病毒40(simian virus 40，SV40)增強子序列，全長237 bp。測序鑒定SV40增強子序列合成正確，設計引物，PCR擴增，并增加酶切位點(12 bp)，其中上游KpnⅠ酶切位點GGTACC，下游SalⅠ酶切位點GTCGAC，引物由上海生物工程有限公司合成。反應體系 50 μl，反應條件:95℃預變性5 min，94 ℃ 55 s，57 ℃ 50 s，72 ℃ 50 s，共35 個循環(huán)，最后72℃延伸10 min;將擴增的片段插入到質粒pEGFP-MU的KpnⅠ和SalⅠ兩酶切位點之間，構建載體pEGFP-MU-SV40e;將連接反應液轉化大腸桿菌DH5a，篩選陽性菌落、提取質粒DNA，分別雙酶切和PCR擴增、測序鑒定，正確者作為本實驗的陽性對照載體。根據HPSE之DNA序列設計引物，從人血基因組中PCR擴增上述候選增強子序列1～10，并增加上述酶切位點，上游Kpn I位點后面序列分別與候選增強子enhx序列5'端吻合，下游SalⅠ位點后面序列分別與enhx序列3'端互補，預計enh6擴增序列長度為1 092 bp(包括完整的序列1 080 bp和酶切位點12 bp)，其余片段擴增序列長度為1 212 bp(包括完整的候選增強子序列1 200 bp和酶切位點12 bp)。同法構建實驗載體pEGFP-MU-enhx并鑒定。

1.4 質粒轉染和功能分析

人腫瘤細胞株BEL-7402、SGC-7901常規(guī)方法復蘇、傳代、凍存和培養(yǎng)。提取質粒，選取生長狀態(tài)良好、處于對數(shù)生長期的細胞，待融合度達80%調整細胞計數(shù)，使用6孔板鋪板，細胞轉染按照Lipofectamine 2000說明書操作。在37℃的CO2培養(yǎng)箱中孵育細胞40 h。貼壁細胞用0.25%的胰酶消化后，用含血清培養(yǎng)基終止消化。所有轉染條件相同，轉染時間為48 h，然后進行熒光顯微鏡下觀察和流式細胞分析，檢測熒光強度和轉染效率。實驗重復3次，取平均值。

2 結 果

2.1 對照質粒的構建和鑒定

SV40增強子PCR產物1%瓊脂糖凝膠電泳顯示，擴增條帶(長度為249 bp，包括SV40增強子的完整序列和酶切位點12 bp)與預期的SV40增強子237 bp片段基本符合，條帶清晰。構建的pEGFP-MU-SV40e載體行KpnⅠ和SalⅠ雙酶切電泳可見2個片段，單一酶切均僅有1個片段，初步證明載體構建正確。以pEGFP-MU-SV40e重組質粒為模板，可擴增出長為SV40增強子序列片段，測序結果包含完整的SV40增強子序列，與GenBank一致。對比一致是從33 bp處至269 bp處，長度為237 bp。從 27～32 bp處為GGTACC是KpnⅠ酶切位點，從270～275 bp處為GTCGAC是SalⅠ酶切位點(圖1)。

圖1 SV40增強子PCR產物部分測序圖Fig 1 Partial sequencing graph of PCR product of SV40 enhancer

2.2 實驗載體pEGFP-MU-enhx的構建和鑒定

10個候選序列PCR產物分別經1%瓊脂糖凝膠電泳顯示，擴增條帶與預期長度1 200 bp片段符合。構建的pEGFP-MU-enhx載體行KpnⅠ和SalⅠ雙酶切電泳可見2個片段，單一酶切均僅有1個片段，初步證明載體構建正確。以pEGFP-MU-enhx重組質粒為模板，可擴增出長為1 200 bp左右的候選增強子序列片段，測序結果包含了完整的候選序列，與GenBank一致(圖2)。對比一致是從33 bp處至1 232 bp處，長度為1 200 bp;27～32 bp處為GGTACC是KpnⅠ酶切位點，1 233～1 238 bp處為GTCGAC是SalⅠ酶切位點。

2.3 重組質粒的真核表達與功能分析

陰性對照質粒pEGFP-MU轉染BEL-7402和SGC-7901細胞后熒光強度較弱;陽性對照質粒pEGFP-MUSV40e、實驗載體 pEGFP-MU-enh6、pEGFP-MU-enh7和pEGFP-MU-enh8轉染BEL-7402和SGC-7901細胞后熒光強度較強，其余實驗載體熒光強度與陰性對照相似(圖3、4)。流式細胞儀分析中以發(fā)光細胞百分比代表細胞的轉染效率。質粒pEGFP-MU在BEL-7402和SGC-7901細胞中的轉染效率較低，質粒pEGFPMU-SV40e、實驗載體 pEGFP-MU-enh6、pEGFP-MU-enh7和pEGFP-MU-enh8轉染效率較高，其余實驗載體轉染效率與陰性對照相似，效率較低(見表1)。

圖2 第7候選片段PCR產物部分測序圖Fig 2 Partial sequencing graph of of PCR product of the 7thcandidate DNA fragment

圖3 各組質粒轉染BEL-7402細胞熒光圖Fig 3 Fluorogram of various kinds of plasmids in BEL-7402 cell

表1 各種載體在腫瘤細胞中的轉染效率比較%Tab 1 Comparison of transcription efficiency of various kinds of plasmids in tumor cells %

3 討 論

圖4 各組質粒轉染SGC-7901細胞熒光圖Fig 4 Fluorogram of various kinds of plasmids in SGC-7901 cell

增強子是基因內的一種DNA特異序列，能夠增強DNA轉錄活性，可與細胞核內轉錄因子(TF)特異結合從而極大地增強啟動子活性。其結構與啟動子相似，也由多個元件組成，通常為100～200 bp長度，核心組件8～12 bp，可以單拷貝或多拷貝串連形式存在［6］。每個基因至少包含一個增強子，既可以定位于基因的兩端，也可以定位在基因中間，甚至遠離基因多達數(shù)千個核苷酸。但與基因編碼序列不同，增強子無法僅僅根據DNA序列加以識別，必須通過實驗證實。鑒定增強子的實驗方法主要有DNA結構分析、序列分析和基因刪除和替換等，軟件預測是鑒定增強子的另一種方法，但不同的軟件預測差異較大，而且結果仍需實驗來驗證［7］，尚難普遍應用。

本研究在前期發(fā)現(xiàn)SV40增強子可增強HPSE啟動子表達活性［8］的基礎上，參考其他文獻［9-10］，選用HPSE基因啟動子上、下游的部分片段作為候選序列，將其分為10段，在其上、下游引物分別添加KpnⅠ和SalⅠ酶切位點，進行PCR擴增，將其克隆插入到含有巨細胞病毒(CMV)啟動子、并經改造過的真核表達載體pEGFP-MU中，構建重組載體pEGFP-MU-enhx。然后分別轉染腫瘤細胞株BEL-7402、SGC-7901，通過免疫熒光觀察和流式細胞儀分析方法檢測增強子候選序列對CMV啟動子轉錄活性的影響，以初步鑒定出具有增強子活性的候選序列。

為準確判斷候選序列活性，本研究以未插入其他序列的質粒pEGFP-MU作為陰性對照。SV40增強子是最早發(fā)現(xiàn)也是迄今功能最強大的病毒增強子，其核心序列是由72 bp的堿基對重復序列構成。研究［11］表明SV40增強子修飾的人端粒酶逆轉錄酶啟動子可以提高轉錄活性2～3倍，而且不影響其腫瘤特異性。我們前期研究［8］也證明，SV40增強子可以增強HPSE啟動子的轉錄活性。本研究中我們采用PCR擴增克隆出SV40增強子序列，并引入KpnⅠ和SalⅠ酶切位點，然后將其插入到改造的質粒pEGFP-MU序列中CMV啟動子上游KpnⅠ和SalⅠ酶切位點之間，構建重組質粒載體pEGFP-MU-SV40e，作為本研究陽性對照載體。電泳和測序結果表明，陽性對照質粒構建成功。

將上述3種質粒分別轉染腫瘤細胞株BEL-7402、SGC-7901，通過免疫熒光觀察和流式細胞儀分析方法檢測各個片段對CMV啟動子轉錄活性的影響，以初步鑒定出具有增強子活性的候選序列。

在同等條件下，將質粒pEGFP-MU、pEGFP-MUSV40e和pEGFP-MU-enhx分別轉染人腫瘤細胞BEL-7402和SGC-7901。48 h后熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)重組質粒pEGFP-MU-enh6、pEGFP-MU-enh7和pEGFPMU-enh8e在人腫瘤細胞BEL-7402和SGC-7901中均表達較強的熒光，與陽性對照pEGFP-MU-SV40e相似。其余質粒比陽性對照pEGFP-MU-SV40e低，與陰性對照pEGFP-MU較接近。流式細胞儀與熒光觀察結果一致。初步提示第6、7和8活性片段可以增強CMV啟動子(驅動熒光蛋白表達)轉錄活性，且與SV40增強子相當。

腫瘤特異性啟動子可驅動目的基因的靶向表達，增強子能夠協(xié)同啟動子顯著增強治療基因的表達水平。本研究初步篩選、鑒定了HPSE序列中具有增強子活性的3個DNA片段，為后續(xù)進一步篩選和鑒定有活性的增強子序列縮小了序列搜尋范圍，并為將來利用HPSE增強子進行腫瘤基因治療提供了實驗依據，具有廣闊的應用前景。

［1］VLODAVSKY I，F(xiàn)RIEDMANN Y，ELKIN M，et al.Mammalianheparanase:genecloning expression and function in tumor progression and metastasis［J］.Nat Med，1999，5(7):793-802.

［2］ILAN N，ELKIN M，VLODAVSKY I.Regulation，function and clinical significance of heparanase in cancer metastasis and angiogenesis［J］.Int J Biochem Cell Biol，2006，38(12):2018-2039.

［3］SIMIZU S，ISHIDA K，OSADA H.Heparanase as a molecular target of cancer chemotherapy［J］.Cancer Sci，2004，95(7):553-558.

［4］胡良鶴，陳曉鵬.人乙酰肝素酶核心啟動子的擴增及序列分析［J］.皖南醫(yī)學院學報，2009，28(5):319-321.

［5］陳曉鵬，胡良鶴，王永.人乙酰肝素酶基因啟動子驅動的真核細胞表達載體的構建和功能分析［J］.上海交通大學學報:醫(yī)學版，2010，30(3):314-317.

［6］JASNY B R，ROBERTS L.Solving gene expression［J］.Science，2004，306(5696):629-629.

［7］葛國朝，陳曉鵬.增強子對基因表達調控的研究進展［J］.國際腫瘤學雜志，2011，38(3):173-175.

［8］王永，陳曉鵬.克隆猿猴病毒40增強子修飾人乙酰肝素酶基因核心啟動子及活性分析［J］.東南大學學報:醫(yī)學版，2012，31(1):12-18.

［9］盧圣棟.現(xiàn)代分子生物學實驗技術［M］.中國協(xié)和醫(yī)科大學出版社，1999:539-540.

［10］LI H S，LIU Y，LI D F，et al.Enhancement of DNA vaccineinduced immune responses by a 72-bp element from SV40 enhancer［J］.Chin Med J，2007，120(6):496-502.

［11］ZHANG W M，XUE L Y，XU Y，et al.Improvement of transcriptional activity of hTERT promoter by SV40 enhancer［J］.Zhonghua Bing Li Xue Za Zhi，2006，35(11):691-693.