根癌農(nóng)桿菌介導BDN1基因轉化馬鈴薯的研究

潘映雪 張麗莉* 石 瑛 盧翠華 林忠平

（1東北農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院，黑龍江哈爾濱 150030；2北京大學生命科學學院，北京 100 871）

馬鈴 薯（Solanum tuberosumL.）是茄科、茄屬雙子葉植物，世界上重要的糧菜兼用作物和工業(yè)加工原料作物。據(jù)聯(lián)合國糧農(nóng)組織統(tǒng)計，2009年我國馬鈴薯種植面積達到508.30 萬hm2，占全球馬鈴薯面積的1/4，總產(chǎn)量達7 328.19萬t，占全球總產(chǎn)量的1/5，種植面積和總產(chǎn)量均居世界第1位。據(jù)預測，今后20 a我國糧食還需要增加1億t才能基本滿足人口增長和社會發(fā)展的需要，其中50%將來自馬鈴薯（賈晶霞 等，2011；柳俊，2011；邱彩玲 等，2011）。但是，多種因素制約著馬鈴薯的產(chǎn)量，其中干旱脅迫的影響尤為突出，會引起馬鈴薯體內代謝和生長的可逆性抑制，嚴重時甚至會引起不可逆?zhèn)е抡麄€植株死亡，干旱脅迫導致的馬鈴薯產(chǎn)量減少超過了其他因素所造成的減產(chǎn)的總和。我國現(xiàn)有馬鈴薯主產(chǎn)區(qū)多為土地貧瘠、水資源缺乏、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)條件差的地區(qū)，60%以上馬鈴薯種植在無灌溉條件的干旱和半干旱地區(qū)（FAOSTAT，2009）。對于解決干旱問題主要采取兩種措施，一是采用節(jié)水灌溉技術，如滴灌、微噴等；二是通過生物技術培育耐旱作物品種。前者耗資巨大，極少應用于大田作物，因此培育耐旱的作物品種就日益重要。

本試驗用的脫水蛋白基因BDN1是由北京大學生命科學學院趙恢武等（2000）根據(jù)植物脫水素基因的保守區(qū)域設計引物，從耐旱植物厚葉旋蒴苣苔總cDNA中擴增出來的，與干旱、低溫、鹽堿脅迫應答密切相關。目前，該基因能夠在一定程度上增強煙草（ZHAO et al.，2000）、矮牽牛（王君丹 等，2004）對干旱脅迫的耐受性。將此基因導入馬鈴薯品種東農(nóng)303中，研究轉BDN1基因馬鈴薯對干旱脅迫的反應能力，期望獲得耐旱馬鈴薯材料，為馬鈴薯抗逆育種提供新資源。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

圖1 pCAMBIA2301-BDN1植物表達質粒結構示意圖

1.2 遺傳體系的優(yōu)化

1.2.1 不同激素濃度配比培養(yǎng)基對薯塊再生的影響 以MS培養(yǎng)基作為基礎添加玉米素（ZT）和吲哚乙酸（IAA）兩種激素，設計9種組合（表1），研究激素不同濃度配比對薯塊出芽率的影響，篩選出最佳激素濃度配比培養(yǎng)基。

1.2.2 菌液濃度和侵染時間對遺傳轉化效率的影響 調整工程菌液的OD600值分別達到0.5、0.7、0.9，侵染馬鈴薯薯塊，侵染時間分別為3、5、7 min（表2），培養(yǎng)20 d后統(tǒng)計薯塊出芽率和污染率。

表1 薯塊再生培養(yǎng)基的激素配比

表2 不同菌液濃度和侵染時間處理組合

1.2.3 共培養(yǎng)時間對遺傳轉化的影響 將侵染后的薯塊共培養(yǎng)1、2、3、4 d后轉入分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)，20 d后統(tǒng)計薯塊出芽率和污染率，確定最佳共培養(yǎng)時間。

1.2.4 脫菌劑濃度對遺傳轉化的影響 將對數(shù)期的農(nóng)桿菌菌液的OD600調整為0.7，分別接種在含有進口頭孢噻肟鈉、羧芐青霉素兩種抗生素的固體YEB培養(yǎng)基上，設0、150、200、250、300、350 mg·L-16種濃度，接種4 d后觀察抗生素的抑菌效果。在有效的最小抑菌濃度下進一步做薯塊外植體敏感性試驗。共培養(yǎng)后接種到含有抗生素的薯塊分化培養(yǎng)基上，20 d后調查薯塊出芽率和污染率。

1.2.5 選擇壓力在芽誘導階段的影響 將薯塊接種到卡那霉素（Kan）濃度分別為0、50、75、100、125、150 mg·L-1的篩選培養(yǎng)基上，20 d后統(tǒng)計薯塊出芽率。

1.3 轉基因植株的獲得

取打破休眠的馬鈴薯品種東農(nóng)303的脫毒微型薯，表面消毒，去皮切成大小1 cm2、厚度1～2 mm的薄片，用工程菌液（OD600=0.7）侵染薯塊5 min（盧翠華 等，2009），期間輕輕震蕩使菌液與薯塊充分接觸，吸干薯塊表層多余菌液后接種到培養(yǎng)基上共培養(yǎng)2 d。共培養(yǎng)結束后轉接到含脫菌抗生素的培養(yǎng)基上，7d后將薯塊轉接到分化培養(yǎng)基上誘導薯塊出芽，待不定芽長到1 cm以上時，切下并轉入生根培養(yǎng)基上進行生根擴繁。

1.4 轉基因植株的檢測

1.4.1 轉基因植株的PCR檢測 采用植物基因組DNA小量快速試劑盒提取馬鈴薯植株的總DNA，以轉基因植株的總DNA為模板，以未轉基因植株的總DNA 作陰性對照，pCAMBIA2301質粒作陽性對照。根據(jù)BDN1基因序列，設計特異性引物，擴增目的基因。

引物序列：上游引物PⅠ：5'-CCGATTACCAACATCACGAGC-3'下游引物PⅡ：5'-TTGGGATGGTAGCCTGGAAG-3'

使用COMSOL軟件進行多物理場耦合計算。采用四面體網(wǎng)格和邊界層網(wǎng)格進行網(wǎng)格劃分。網(wǎng)格獨立性檢驗如下：對三分支微通道熱沉的參數(shù)最大熱應力σ進行檢驗，粗化網(wǎng)格、標準網(wǎng)格、細化網(wǎng)格的網(wǎng)格數(shù)量分別為105564、265365、422340，粗化網(wǎng)格與標準網(wǎng)格計算下的相對誤差為0.42%，細化網(wǎng)格與標準網(wǎng)格計算下的相對誤差為0.27%。綜合考慮計算精度和計算時間，采用標準網(wǎng)格劃分，如圖3所示。

1.4.2 轉基因植株的Southern-blot檢測 質粒DNA的純化與回收采用小量膠回收試劑盒；探針標記采用隨機引物法；用EcoR I酶切經(jīng)PCR擴增呈陽性的轉基因植株的總DNA，將酶切產(chǎn)物在0.8%瓊脂糖凝膠上電泳，經(jīng)變性、中和后用高鹽轉移法將膠上的樣品轉移到尼龍膜上，以目的基因BDN1為探針，采用地高辛試劑盒進行雜交、洗膜、顯影。

1.4.3 轉基因植株的半定量RT-PCR檢測 采用通用植物總RNA快速提取試劑盒提取抗性轉基因植株的總RNA，反轉錄所用試劑盒為TaKaRa公司的RNA PCR Kit（AMV）Ver.3.0。以RNA反轉錄成的cDNA為模板，用BDN1引物進行PCR擴增反應。

1.4.4 轉基因植株的生理檢測 將Southern-blot雜交陽性植株及對照未轉基因植株移栽入網(wǎng)室，轉基因植株和對照未轉基因植株分別種植2行，行長3 m，行距50 cm，待苗長至15～16片葉時澆足水，取植株倒數(shù)第4片葉進行各生理指標的測定，3次重復；然后遮蓋防雨棚對其進行干旱處理，持續(xù)控水15 d后再取樣測定相應生理指標。葉片相對含水量（Leaf Relative Water Content，RWC）參照李合生等（2000）的方法測定；脯氨酸含量、丙二醛（MDA）含量和超氧化物歧化酶（SOD）活性的測定參照張永成和田豐（2007）的方法測定。

2 結果與分析

2.1 遺傳轉化體系的優(yōu)化

2.1.1 不同激素濃度配比培養(yǎng)基對薯塊再生的影響 由表3可見，當ZT和IAA濃度分別為4.0 mg·L-1和1.0 mg·L-1時，愈傷的誘導率最高，達86.36%，且愈傷組織的質量和狀態(tài)最好，因此確定薯塊再生培養(yǎng)基為M5，即：MS+4.0 mg·L-1ZT+1.0 mg·L-1IAA。

2.1.2 菌液濃度和侵染時間的確定 農(nóng)桿菌濃度和侵染時間對遺傳轉化效率影響明顯（表4）。當菌液濃度OD600=0.7，侵染時間為5 min時，東農(nóng)303薯塊出芽率為90.91%，污染率為9.09%，因此，確定農(nóng)桿菌菌株LBA4404侵染薯塊的最佳濃度為OD600=0.7，侵染時間為5 min。

表3 不同再生培養(yǎng)基對薯塊出芽率的影響

表4 不同侵染條件對遺傳轉化效率的影響

2.1.3 共培養(yǎng)時間對遺傳轉化效率的影響薯塊與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)的時間對馬鈴薯遺傳轉化的影響很大，時間過長或過短都會影響轉化效率。共培養(yǎng)2 d，東農(nóng)303薯塊出芽率最高能達到85%，污染率較低僅為10%（圖2）。

2.1.4 脫菌劑濃度的確定 在薯塊外植體敏感性試驗中，分別將2種抗生素以其相應的最小抑菌濃度接種于薯塊分化培養(yǎng)基中。由表5可見，羧芐青霉素濃度為300 mg·L-1時，東農(nóng)303薯塊出芽率較低，污染率高；進口頭孢噻肟鈉濃度為150 mg·L-1時，薯塊出芽率為92%，沒有污染。因此本試驗選用進口頭孢噻肟鈉作為脫菌劑，濃度為150 mg·L-1。

2.1.5 篩選劑濃度對薯塊再生的影響 將薯塊接種到 Kan濃度為 0、50、75、100、125和150 mg·L-1的篩選培養(yǎng)基上，20 d后統(tǒng)計出芽率。如表6所示，東農(nóng)303在Kan濃度為100 mg·L-1時，只有少數(shù)薯塊分化出芽，出芽率為35.00%。當Kan濃度繼續(xù)提高時，愈傷組織的誘導被完全抑制，接種的薯塊也完全壞死。因此，確定芽誘導階段Kan濃度為100 mg·L-1。

圖2 共培養(yǎng)時間對薯塊遺傳轉化效率的影響

表5 不同種類抗生素對薯塊遺傳轉化的影響

2.2 再生植株的分子檢測

經(jīng)過20 d分化培養(yǎng)，共獲得35株Kan抗性植株。圖3顯示了馬鈴薯薯塊遺傳轉化各階段的生長情況。經(jīng)PCR檢測27株呈陽性（圖4），特異條帶長度為700 bp，與目的基因大小一致。進一步的Southern-blot雜交檢測4株有雜交信號（圖5），初步表明BDN1基因已經(jīng)整合到馬鈴薯基因組中。對Southern-blot雜交有雜交信號的4株轉基因植株進行總RNA的提?。▓D6），以RNA反轉錄成的cDNA為模板用BDN1基因引物進行PCR擴增，結果如圖7所示，通過半定量RT-PCR擴增出的目的條帶為700 bp，與目的基因大小相吻合，說明BDN1基因能夠正常轉錄表達。

表6 Kan濃度對薯塊出芽率及生長狀態(tài)的影響

圖3 馬鈴薯薯塊遺傳轉化及抗性植株的獲得

圖4 抗性植株PCR檢測

圖5 抗性植株Southern-blot檢測

圖6 抗性植株總RNA電泳

圖7 抗性植株BDN1基因表達結果

2.3 再生植株的生理檢測

對獲得的轉基因植株進行了干旱脅迫處理，圖8為干旱脅迫下轉基因植株和對照的生長及結薯情況。采用SPSS統(tǒng)計分析軟件對4項生理指標進行差異顯著性分析，由表7可以看出，正常給水條件下，對照和轉基因植株的相對含水量、脯氨酸含量、MDA含量和SOD活性差異均不大，在受到干旱脅迫后，轉基因植株相對含水量、脯氨酸含量、丙二醛含量和SOD活性均與對照未轉基因植株差異顯著，這表明在受到干旱脅迫時轉BDN1基因植株能夠迅速做出反應，具有一定的抗旱能力。

圖8 干旱脅迫下轉基因植株與對照生長及結薯情況

表7 干旱脅迫下轉基因植株生理指標變化情況

3 結論與討論

由于馬鈴薯的轉化具有很強的基因依賴性，所以即使同一材料的遺傳轉化，不同的激素配比和其他轉化條件也不盡相同。一般認為馬鈴薯的遺傳轉化效率受植物的基因型、外植體、激素配比、共培養(yǎng)時間等因素的影響。在進行農(nóng)桿菌侵染前，莖段和葉片需要進行一定時間的預培養(yǎng)，微型薯則不需要，可直接用于侵染，且微型薯營養(yǎng)物質豐富，農(nóng)桿菌侵染后易于轉化，不經(jīng)愈傷分化直接由胚性細胞誘導再生植株，因而采用微型薯作為遺傳轉化的受體材料已成為一種趨勢。再生培養(yǎng)基中的激素配比濃度是影響植株再生的關鍵因素，本試驗設計了9種ZT和IAA的不同配比濃度組合，當ZT濃度為4.0 mg·L-1，IAA濃度為1.0 mg·L-1時，薯塊再生情況最好。共培養(yǎng)時間是馬鈴薯遺傳轉化成功的關鍵，農(nóng)桿菌只有在創(chuàng)傷部位生存16 h以上轉移過程才能完成。如果共培養(yǎng)時間過長，農(nóng)桿菌在培養(yǎng)基及受體表面上會過分生長，不利于薯塊的存活以及隨后抗性愈傷篩選時對農(nóng)桿菌的抑制。共培養(yǎng)2 d時，薯塊出芽率最高達到85%，污染率較低；本試驗選用進口頭孢噻肟鈉作為脫菌劑，用于共培養(yǎng)后抑制農(nóng)桿菌的生長，在濃度為150 mg·L-1時抑菌效果好，薯塊出芽率為92%。在外植體與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)后，如果立即添加Kan進行篩選，則使得大量植物受體細胞在外源基因還未整合到基因組中就受到Kan的毒害，薯塊褐化嚴重甚至死亡。本試驗采用延遲7 d的篩選方式，有利于轉化細胞的生長，出芽率比較高，但假轉化體增多，生根的35株抗性植株中只有4株Southern-blot檢測為陽性，經(jīng)半定量RTPCR檢測BDN1基因在馬鈴薯植株內能夠正常表達。

脫水素（dehydrin）是LEA蛋白中的一類，廣泛存在于植物的各個組織器官及植物胚胎發(fā)育后期。脫水素是植物在受低溫、干旱和高鹽等非生物逆境脅迫時合成的一類高親水性保護蛋白，具有保護核酸、胞內蛋白和膜結構免受損害的功能。許多研究已經(jīng)證實在非生物脅迫下，植物脫水素的表達與積累和植物抗逆性之間存在著緊密的聯(lián)系。本試驗中將脫水素蛋白基因BDN1導入馬鈴薯中，對獲得的馬鈴薯抗性轉基因植株進行干旱脅迫，測定其生理生化指標，綜合評定了轉基因植株與對照未轉基因植株間的抗旱性差異；試驗結果表明BDN1基因在馬鈴薯中有較強的表達，轉基因植株的葉片保水能力強，滲透調節(jié)物質含量增幅較大，膜脂過氧化程度相對較小，能維持較高水平的酶活性，從而能忍耐一定程度的干旱脅迫。然而對于轉基因馬鈴薯在抗寒、耐鹽方面的能力及其后代穩(wěn)定性等諸多方面的研究還有待于進一步深入。本試驗希望將BDN1基因轉入馬鈴薯，培育抗旱馬鈴薯新品種，從而為提高馬鈴薯的產(chǎn)量打下基礎。

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