番茄溫敏型核雄性不育系T-4花藥蛋白質(zhì)含量、POD及EST同工酶的研究

國亞慧 于分弟 甘桂云 韋冠睦 王先裕，6* 杜永臣 桝田正治

（1廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院，廣西南寧 530004；2廣西來賓合山市嶺南鎮(zhèn)人民政府，廣西來賓 546500；3廣西柳州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，廣西柳州 545003；4中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所，北京100081；5日本岡山大學(xué)，日本700－8530；6國家大宗蔬菜產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系桂林綜合試驗站，廣西桂林 541004 ）

番茄（Lycopersicon esculentumMill.）屬于茄科番茄屬（Lycopersicon），自花授粉作物。植物育性是由基因控制的生理過程、生化反應(yīng)和形態(tài)構(gòu)建的最終結(jié)果。物質(zhì)代謝是植物生命活動的基礎(chǔ)，是植株間的生理生化差異的反映。在發(fā)育過程中正常發(fā)育的花藥和花粉會積累一些物質(zhì)，如蛋白質(zhì)、核酸、碳水化合物（可溶性糖和淀粉）和某些氨基酸等，而雄性不育系花藥或花粉則相對缺乏。夏濤和劉紀(jì)麟（1993）在研究玉米細胞質(zhì)雄性不育系的物質(zhì)代謝時，提出了“物質(zhì)虧損”的概念，提出結(jié)構(gòu)物質(zhì)、營養(yǎng)物質(zhì)、能量物質(zhì)的虧損現(xiàn)象嚴(yán)重影響小孢子的發(fā)育。國內(nèi)外已對水稻（孫谷疇 等，1997；張明永 等，1997）、油菜（蔣梁材和劉啟鑫，1994）、小麥（張愛民 等，1996；張花 等，1996）、大白菜（王淑華 等，1998）、辣椒（耿三省 等，1997）及甜菜（孫立險，1986）、榨菜（胡美華 等，2000）等作物的不育花粉（藥）或葉片中氨基酸、同工酶、蛋白質(zhì)等生化物質(zhì)的異常進行了研究，揭示了雄性不育的生化機理。

王保仁等（1980）、劉忠松（1987）發(fā)現(xiàn)湘矮A CMS（屬Pol CMS 胞質(zhì)）不育系及相應(yīng)保持系間過氧化物酶（POD）同工酶譜帶存在差異；陳松等（1995）研究認(rèn)為油菜不育系及其同型保持系的EST同工酶譜帶也有差異，胞質(zhì)基因的不同會導(dǎo)致基因產(chǎn)物酯酶（EST）的不同；林寶剛等（2005）對Pol CMS、陜2A CMS及其同一保持系陜2B 的種子進行EST、POD同工酶比較分析后發(fā)現(xiàn)，不育材料種子的EST、POD同工酶都與保持系具有較大差異。李殿榮（1986）報道，雜交油菜秦油2號及其親本植株不同營養(yǎng)器官的EST、POD同工酶酶譜間存在著差異。張子學(xué)等（2008）研究表明，辣椒不育系與保持系材料的POD同工酶活性及種類、EST同工酶酶帶在花藥不同發(fā)育時期存在差異，超氧化物歧化酶（SOD）同工酶活性及種類無明顯差異。截至目前對番茄不育系同工酶的研究報道甚少。雄性不育系在番茄育種中扮演著重要的角色，不但省工、省力，少去了人工去雄的步驟，還能提高種子質(zhì)量，減少假種子的混雜。本試驗主要對番茄溫敏型核雄性不育系T-4的蛋白質(zhì)、POD及EST同工酶進行研究，探索該材料不育的機理，為更好地研究和利用不育系提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料為溫敏型核雄性不育系T-4和對照First，是由日本岡山大學(xué)農(nóng)學(xué)部作物繁殖研究室桝田正治教授提供。在日本，T-4為對照First經(jīng)γ射線輻照后所得的變異突變體，當(dāng)溫度達到某一范圍時，T-4可恢復(fù)部分育性，高于或低于該臨界溫度范圍則表現(xiàn)為雄性不育，臨界溫度為20 ℃（Masaharu MASUDA and Christopher O.OJIEWO．2006）。不同地區(qū)T-4核雄性不育性表現(xiàn)出不同的臨界溫度，即臨界溫度遷移現(xiàn)象。在廣西南寧地區(qū)，夜溫為20 ℃左右是T-4育性轉(zhuǎn)換的臨界溫度，夜溫高于臨界溫度時表現(xiàn)為不育，低于14 ℃時也表現(xiàn)為不育（王先裕 等，2011）。

1.2 試驗方法

材料于2010年8月在廣西大學(xué)玻璃溫室中育苗，兩片真葉時轉(zhuǎn)入人工培養(yǎng)箱中進行處理。共設(shè)3個處理，處理的溫度分別為晝28 ℃/夜24 ℃，晝28 ℃/夜18 ℃以及晝28 ℃/夜12 ℃，每天光照12 h（7：00～19：00），濕度為70%。每個處理4株，對照為First，3次重復(fù)。

采集當(dāng)天開放的花朵，在-80 ℃下保存，用于蛋白質(zhì)、POD及EST同工酶的測定分析。蛋白質(zhì)用考馬斯亮藍G-250染色分光光度法測定；POD及EST同工酶采用聚丙烯酰胺凝膠垂直板電泳法進行測定。

蛋白質(zhì)提取測定：準(zhǔn)確稱取約0.1 g番茄花藥，放入研缽中，加入2 mL蒸餾水在冰浴中研成勻漿，離心（4 000 r·min-1，10 min），將上清液倒入10 mL容量瓶，再向殘渣中加入2 mL蒸餾水，懸浮后再離心10 min，合并上清液，定容至刻度。

另取1支具塞試管，準(zhǔn)確加入0.1 mL樣品提取液，再加入0.9 mL蒸餾水、5 mL考馬斯亮藍G-250試劑，充分混合，放置2 min后，以標(biāo)準(zhǔn)曲線1號試管做參比，在595 nm波長下比色，記錄吸光度。根據(jù)所測樣品提取液的吸光度，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得相應(yīng)的蛋白質(zhì)含量，計算樣品蛋白質(zhì)含量。

花藥POD液、EST液的提取：稱量0.1 g花藥，放入研缽中，加入pH 8.3Tris-HCl和20%的蔗糖緩沖液，在低溫下研磨至勻漿，在4 000 r·min-1離心15 min。取上清液放入超低溫恒溫冰箱-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

染色方法：POD同工酶采用聯(lián)苯胺染色法；EST同工酶用α-醋酸萘酯、β-醋酸萘酯及堅牢藍RR鹽染色液染色。計算相對遷移率（Rf）。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同溫度處理下T-4與對照First花藥中蛋白質(zhì)含量

從表1中可以看出，對照First在3個溫度處理下（夜溫分別為24 ℃、18 ℃及12 ℃時）的蛋白質(zhì)含量分別為2.85、2.75 μg·g-1及2.84 μg·g-1，三者之間差異不顯著。T-4在晝28℃/夜24 ℃及晝28 ℃/夜12 ℃的處理下的蛋白質(zhì)含量分別為1.67μg·g-1和1.43μg·g-1，顯著低于晝28℃/夜18℃處理；在晝28 ℃/夜18 ℃處理下T-4蛋白質(zhì)含量與對照First差異不顯著。即T-4在不育溫度條件下（夜溫高于20℃或低于14℃）的蛋白質(zhì)含量顯著低于可育溫度條件下的蛋白質(zhì)含量，且顯著低于對照First。

表1 不同溫度處理下T-4與對照First花藥中蛋白質(zhì)含量

2.2 不同溫度處理下T-4與對照First花藥POD及EST同工酶酶譜

從圖1可以看出，在3個溫度處理下對照First的POD同工酶酶譜無明顯差異。T-4在晝28℃/夜18 ℃的可育條件下的POD同工酶酶譜與對照First間無明顯差異。T-4在不育溫度條件下，即晝28 ℃/夜24℃和晝28 ℃/夜12℃時POD同工酶酶譜，較可育溫度條件下多了一條遷移率為0.143的譜帶P1。表明T-4在晝28 ℃/夜24℃和晝28 ℃/夜12℃不育溫度條件下花藥的POD同工酶譜帶與可育溫度處理存在差異。

從圖2可以看出，在晝28℃/夜18℃的可育條件下，T-4 的EST同工酶酶譜共出現(xiàn)了4條酶帶；在晝28℃/夜24℃和晝28℃/夜12℃不育條件下，出現(xiàn)6條酶帶。即可育溫度條件下的EST同工酶酶譜比不育溫度條件下少了遷移率分別為0.415及0.491的2條譜帶，分別以E3和E4表示。對照First在3個溫度處理下酶譜無明顯差異。可育溫度條件下T-4的EST同工酶酶譜與對照First無顯著差異。表明對溫敏型雄性不育系T-4進行不同溫度處理，EST同工酶的譜帶存在差異，可育溫度條件下同工酶的譜帶少于不育溫度處理。

綜上所述，在不同溫度處理下，T-4花藥中POD、EST同工酶酶譜有差異，不育溫度條件下的POD、EST同工酶均表現(xiàn)為有較多譜帶，而可育溫度條件下的譜帶則較少。

圖1 3個不同溫度處理下T-4與對照First花藥中POD同工酶酶譜

圖2 3個不同溫度處理下T-4與對照First花藥中EST同工酶酶譜

3 結(jié)論與討論

本試驗結(jié)果表明，在不育溫度條件下T-4的花藥中蛋白質(zhì)含量顯著低于可育溫度條件下的蛋白質(zhì)含量，且顯著低于對照First花藥中蛋白質(zhì)含量；同工酶酶譜的分析顯示，T-4在不育溫度條件下花藥中的POD同工酶和EST同工酶譜帶數(shù)量均多于可育溫度處理。從試驗結(jié)果可推測，番茄花藥中蛋白質(zhì)的含量高低及POD同工酶和EST同工酶的表達均對育性表現(xiàn)存在一定的影響。本試驗僅從花藥中蛋白質(zhì)的角度對番茄育性表現(xiàn)進行了研究，為了更好地了解番茄雄性不育的發(fā)生機理，有待進行全方位地剖析，從而更好地利用番茄雄性不育系在育種中的優(yōu)勢。探索簡易的操作方式來對番茄雄性不育系進行篩選是一大難題，目前僅僅從外觀形態(tài)和簡單的花粉萌發(fā)情況對雄性不育系的育性進行判定，存在很大的不穩(wěn)定性和不準(zhǔn)確性，為了進一步探索不育系的育性作用機理，本試驗從蛋白質(zhì)水平上對其進行分析，有待從基因水平上對其進行定位。

陳松，蒲惠明，戚存扣．1995．甘藍型雙低油菜三系及雜種酯酶同工酶分析.江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，（2）：27-28.

耿三省，毛愛軍，蔣健箴．1997．辣椒雄性不育花藥的生化特性．北京農(nóng)業(yè)科學(xué)，15（2）：26-27.

胡美華，陳竹君，汪炳良．2000．榨菜胞質(zhì)雄性不育系及其保持系過氧化物酶和酯酶同工酶的比較研究．浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報，12（4）：201-205.

蔣梁材，劉啟鑫．1994．甘藍型油菜雄性不育系與可育系花蕾的生理生化特性．中國油料，16（1）：11-14.

李殿榮．1986．甘藍型油菜雄性不育系、保持系、恢復(fù)系選育成功并大面積推廣．中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，4（4）：94.

林寶剛，張明龍，王桂榮．2005．輻照誘導(dǎo)的新雄性不育系過氧化物酶和酯酶同工酶分析．核農(nóng)學(xué)報，19（4）：304-306.

劉忠松．1987．高等植物雄性不育的生理生化研究進展．植物生理學(xué)通訊，23（2）：16-21.

孫谷疇，林植芳，林桂珠，梁承鄴．1997．細胞質(zhì)雄性不育水稻幼穗和花藥發(fā)育期的蛋白酶活性變化．熱帶亞熱帶植物學(xué)報，5（4）：45-51.

孫立險．1986．甜菜雄性不育系及保持系的過氧化物酶同工酶初步分析．中國糖料，（4）：21-25．

王保仁，常桂菊，胡能書．1980．湘矮型油菜“三系”及其雜種過氧化物酶同工酶的初步研究．湖南農(nóng)業(yè)科技，（6）：16-21．

王淑華，魏毓棠，馮輝，佟景春．1998．大白菜雄性不育株與可育株花蕾生理生化特性比較分析．沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，（2）：132-137.

王先裕，于分弟，梁聰耀，李良韶，黃維娜，杜永臣，劉政國，曾東，潘立凡．2011．溫敏型核雄性不育系番茄T4育性的研究．中國蔬菜，（14）：64-68.

夏濤，劉紀(jì)麟．1993．玉米細胞質(zhì)雄性不育系物質(zhì)代謝系統(tǒng)的研究．華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，12（1）：1-6.

張愛民，李英賢，黃鐵城．1996．小麥雄性不育與內(nèi)源激素關(guān)系的初步研究．農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報，4（1）：56-61.

張花，何之常，徐乃瑜．1996．不同細胞質(zhì)雄性不育小麥陽離子過氧化物酶和IAA-氧化酶活性的研究．武漢大學(xué)學(xué)報，42（6）：728-732.

張明永，田長恩，梁承鄴，黃毓文，劉鴻先．1997．細胞質(zhì)雄性不育水稻幼穗和花藥的呼吸酶活性研究．熱帶亞熱帶植物學(xué)報，5（4）：52-55．

張子學(xué)，王麗，王志杰．2008．辣椒雄性不育系與保持系花藥POD、SOD和EST同工酶表達差異研究．安徽生物學(xué)報，17（4）：616-622.