高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定飼料中多種酚類(lèi)抗氧化劑和尼泊金酯類(lèi)防腐劑

樂(lè)山市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)所 楊春林 李佳峻 胡 強(qiáng) 吳 蔚 呂小艇

脂類(lèi)氧化酸敗是飼料在加工、儲(chǔ)運(yùn)和使用過(guò)程中發(fā)生品質(zhì)惡化的主要原因之一 （黃濤等，2004）。在飼料中添加抗氧化劑能夠阻止或延緩飼料中某些營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)氧化，延長(zhǎng)飼料貯存時(shí)間（張曼等，2006）?？勺鳛榭寡趸瘎┑奈镔|(zhì)很多，其中沒(méi)食子酸丙酯（PG）、叔丁基羥基茴香醚（BHA）、2，6-二叔丁基對(duì)甲酚（BHT）和叔丁基對(duì)苯二酚（TBHQ）等酚類(lèi)抗氧化劑目前應(yīng)用最為廣泛（楊曉鳳，2011）。除此之外，防腐劑也是常用的保證飼料安全衛(wèi)生的手段。尼泊金酯（又名對(duì)羥基苯甲酸酯）作為常用防腐劑之一，其抑菌范圍廣、毒性低、防腐效率高且防腐效果受pH變化的影響小，是飼料中常用的防腐劑（周建科等，2010）。由于人工合成的防腐劑和抗氧化劑對(duì)機(jī)體具有不同程度的毒副作用，在飼料中過(guò)量使用，會(huì)在動(dòng)物體內(nèi)造成殘留（鄭萍和陳西平，2008）。目前，酚類(lèi)抗氧化劑和尼泊金酯類(lèi)防腐劑的檢測(cè)方法主要有高效液相色譜法（曹淑瑞等，2012；胡小鐘等，2000）、氣相色譜法 （李興根和韓世玲，2006）、氣相色譜-質(zhì)譜法（郭嵐等，2007）、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（汪雋等，2008；林安清等，2007）、薄層色譜法（朱玉和李永紅，1998）及膠束電動(dòng)毛細(xì)管電泳法 （曹小妹等，2012；高勇等，2010；Blanco 等，2009）。這些方法大多只針對(duì)其中一類(lèi)物質(zhì)的檢測(cè)，同時(shí)檢測(cè)上述兩類(lèi)物質(zhì)的方法少有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)樣品前處理方法、檢測(cè)通道、流動(dòng)相組成及梯度洗脫程序等色譜條件進(jìn)行優(yōu)化，建立了同時(shí)測(cè)定飼料中4種酚類(lèi)抗氧化劑和3種尼泊金酯類(lèi)防腐劑的高效液相色譜分析方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 高效液相色譜儀LC-20A（配自動(dòng)進(jìn)樣系統(tǒng)、二極管陣列檢測(cè)器），日本Shi-madzu公司；Milli-Q超純水系統(tǒng)，美國(guó)Millipore公司；氮吹儀N-EVAP，美國(guó)Organomation公司；電子天平DV215CD（精確至0.00001 g），美國(guó)O-haus公司；超聲波清洗器，上海冠特超聲儀器有限公司。

甲醇、乙腈（色譜純），美國(guó)Tedia公司；標(biāo)準(zhǔn)品：尼泊金甲酯（MHB）、尼泊金乙酯（EHB）、尼泊金丙酯（IPHB）、沒(méi)食子酸丙酯（PG）、丁基羥基茴香醚（BHA）、二丁基羥基甲苯（BHT）及特丁基對(duì)苯二酚（THBQ），均購(gòu)自德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司。1.2 色譜分析條件 色譜柱：Inertsil ODS-sp C18 （4.6 mm × 250 mm，5 μm）； 流動(dòng)相：A 為甲醇，B為酸性乙酸銨溶液（pH值為3.5），使用前過(guò)0.22 μm 濾膜； 梯度洗脫程序：0～3 min，B為45%；3～8 min，B從45%線性降至 0，保持7 min；15～20 min，B從0線性升至45%，保持7 min。柱溫：40 ℃，流速：1.0 mL/min，進(jìn)樣量 20 μL；采用雙通道法分別在波長(zhǎng)280 nm和256 nm對(duì)兩類(lèi)物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液配制 準(zhǔn)確稱(chēng)取尼泊金甲酯、尼泊金乙酯、尼泊金丙酯、沒(méi)食子酸丙酯、丁基羥基茴香醚、二丁基羥基甲苯及特丁基對(duì)苯二酚標(biāo)準(zhǔn)品各10 mg（精確至0.01 mg），用色譜純的甲醇溶解并定容成濃度為200 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液適量用甲醇-乙腈溶液 （30∶70，V∶V）稀釋定容成濃度為0.10、1.00、5.00、10.00、25.00、50.00、100.00 μg/mL的工作溶液，取20 μL進(jìn)樣測(cè)定峰面積，以質(zhì)量濃度對(duì)峰面積作曲線。

1.4 樣品處理 準(zhǔn)確稱(chēng)取粉碎后過(guò)80目篩的飼料樣品1 g（精確至0.0001 g）于50 mL比色管中，加入3 mL色譜純甲醇充分潤(rùn)濕后于漩渦振蕩器上振蕩2 min，再加入7 mL乙腈，40℃條件下超聲提取15 min，8000 r/min離心5 min，取上層有機(jī)相；重復(fù)提取3次，合并有機(jī)相，定性濾紙過(guò)濾后用0.2 μm針孔過(guò)濾器濾于雞心瓶中；45℃條件下用氮吹儀吹至近干，甲醇-乙腈溶液（30∶70，V∶V）溶解殘?jiān)⒍ㄈ葜? mL，待測(cè)。

1.5 回收率與精密度 取粉碎過(guò)篩后的均勻飼料樣品3份，加入7種標(biāo)準(zhǔn)品的混合溶液，使其含量分別為10、30、50 mg/kg，按1.4中的方法進(jìn)行樣品前處理。每個(gè)處理重復(fù)6次，按1.2中的色譜條件對(duì)加標(biāo)樣品提取液中的7種目標(biāo)化合物定量，考察方法的回收率和精密度。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜柱及洗脫條件選擇 色譜柱的填料組分、粒徑大小、規(guī)格型號(hào)等因素對(duì)目標(biāo)化合物的保留效果尤其是多組分的有效分離具有重要的影響，所以選擇適合的色譜柱是實(shí)現(xiàn)多組分化合物的分離和定量的關(guān)鍵步驟。本實(shí)驗(yàn)分別比較了4種色譜柱對(duì)7種目標(biāo)化合物的分離效果，色譜柱Ⅰ：ZORBAX Eclipse Plus C18 （4.6 mm × 100 mm，3.5 μm）； 色譜柱Ⅱ：ZORBAX Eclipse Plus C18（4.6 mm × 150 mm，5 μm）；色譜柱Ⅲ：ZORBAX SB-C18（4.6 mm × 150 mm，5 μm）；色譜柱Ⅳ：Inertsil ODS-sp C18（4.6 mm × 250 mm，5 μm）。在實(shí)驗(yàn)的過(guò)程中同時(shí)優(yōu)化確立了甲醇-乙酸銨溶液（用甲酸調(diào)節(jié)pH至3.5）作為流動(dòng)相的梯度洗脫程序。結(jié)果表明，在優(yōu)化的流動(dòng)相條件下，色譜柱Ⅰ的峰形較差且有3種目標(biāo)物質(zhì)不能得到基線分離，色譜柱Ⅱ和Ⅲ所得的峰形較色譜柱Ⅰ有一定的改善，但是沒(méi)食子酸丙酯與尼泊金甲酯無(wú)法完全分離，影響該兩種物質(zhì)的準(zhǔn)確定量，色譜柱Ⅳ能使7種物質(zhì)全部實(shí)現(xiàn)基線分離，峰形尖銳對(duì)稱(chēng)。實(shí)驗(yàn)最后以色譜柱Ⅳ作為色譜柱，采用確立的流動(dòng)相及梯度洗脫程序?qū)?種物質(zhì)進(jìn)行高效液相色譜分離，取得不錯(cuò)的效果。

2.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 用二極管陣列檢測(cè)器對(duì)7種目標(biāo)物質(zhì)進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，結(jié)果表明，4種酚類(lèi)抗氧化劑（PG、BHA、BHT、TBHQ）的最大吸收波長(zhǎng)均在280 nm附近，而3種尼泊金酯的最大吸收波長(zhǎng)在256 nm附近。選擇256 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)時(shí)，3種尼泊金酯的靈敏度較高，但是4種抗氧化劑的響應(yīng)值非常低（圖1A），導(dǎo)致方法檢出限偏高；而采用280 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)，則會(huì)大大降低3種尼泊金酯的靈敏度（圖1B）。為了使各種目標(biāo)物質(zhì)的靈敏度達(dá)到最高，我們采用了雙通道法進(jìn)行檢測(cè)，在256 nm波長(zhǎng)條件下對(duì)尼泊金酯定量，280 nm條件下對(duì)酚類(lèi)抗氧化劑定量，7種物質(zhì)的雙通道重疊色譜圖見(jiàn)圖1C。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)混合溶液色譜圖

2.3 樣品提取條件 樣品的提取條件主要包括提取溶劑的組成與比例、提取的方式、提取時(shí)間等因素。其中，提取溶劑的組成與比例不但直接影響樣品中目標(biāo)組分的提取效率并且對(duì)提取液中雜質(zhì)含量的多少具有決定性作用，選擇適合的提取溶劑對(duì)消除雜質(zhì)干擾和提高回收率具有非常積極的意義。通過(guò)渦旋振蕩與超聲波提取相結(jié)合的方法，比較幾種常見(jiàn)的提取溶劑對(duì)回收率的影響，結(jié)果表明，甲醇對(duì)飼料中7種目標(biāo)物質(zhì)的提取效果均比較理想。但是，研究也發(fā)現(xiàn)，飼料中含有的部分脂肪和蛋白質(zhì)會(huì)被甲醇提取出來(lái)，會(huì)帶來(lái)干擾并污染色譜系統(tǒng)。最終采用甲醇-乙腈體系（30∶70，V∶V）作為提取溶劑，利用乙腈對(duì)脂肪的弱溶解性及其對(duì)蛋白質(zhì)的沉淀作用來(lái)消除部分雜質(zhì)干擾。應(yīng)用建立的樣品處理方法和優(yōu)化的色譜條件對(duì)實(shí)際樣品進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明，該方法得到的樣品提取液非常干凈，對(duì)樣品定量的干擾較小，空白樣品及加標(biāo)樣品典型色譜圖見(jiàn)圖2。

2.4 線性范圍、檢出限和定量限 取適量標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液用甲醇-乙腈溶液稀釋定容成濃度為0.10、1.00、5.00、10.00、25.00、50.00、100.00 μg/mL 的工作溶液，取20 μL按儀器工作條件測(cè)定。以質(zhì)量濃度對(duì)峰面積作校正曲線，得到線性回歸方程，7種物質(zhì)濃度為0.1～100.0 μg/mL時(shí)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.9999，線性參數(shù)見(jiàn)表1。以3倍信噪比為檢出限（LOD），計(jì)算得出6種物質(zhì)的檢出限分別為0.027～0.102 mg/L。以10倍信噪比計(jì)算得出定量限 （LOQ）為0.090～0.332 mg/L。

圖2 某品牌魚(yú)飼料空白樣品及加標(biāo)樣品色譜圖

表1 線性參數(shù)、檢測(cè)限（LOD）和定量限（LOQ）

2.5 方法的回收率和精密度 采用在空白飼料樣品中添加混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的方法，對(duì)7種物質(zhì)進(jìn)行3個(gè)濃度水平的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，每個(gè)濃度6次重復(fù)，按建立的試驗(yàn)方法進(jìn)行處理和分析，考察方法的精密度，結(jié)果見(jiàn)表2和表3。7種限量物質(zhì)添加濃度為10.0～50.0 mg/kg，平均回收率為79.62%～112.29%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.65%～8.38%。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立了同時(shí)檢測(cè)飼料中7種限量物質(zhì)的高效液相色譜方法。實(shí)驗(yàn)以有機(jī)溶劑提取飼料中的酚類(lèi)抗氧化劑和尼泊金酯類(lèi)防腐劑，利用乙腈對(duì)脂肪的弱溶解性和對(duì)蛋白質(zhì)的沉淀作用，有效消除雜質(zhì)干擾，定性準(zhǔn)確。采用雙通道法分別在波長(zhǎng)256 nm和280 nm同時(shí)檢測(cè)，最大限度地保證每種目標(biāo)化合物的檢測(cè)靈敏度。本方法對(duì)色譜條件及樣品提取方法進(jìn)行了優(yōu)化，具有速度快、靈敏度高、定量準(zhǔn)確、操作簡(jiǎn)單等特點(diǎn)，可用于飼料中4種酚類(lèi)抗氧化劑和3種尼泊金酯類(lèi)防腐劑的同時(shí)測(cè)定。

表2 飼料中4種抗氧化劑的加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）

表3 飼料中3種尼泊金酯類(lèi)防腐劑的加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）

[1]曹淑瑞，劉治勇，張雷，等.高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定食品中6種對(duì)羥基苯甲酸酯[J].分析化學(xué)，2012，40（4）：529 ～ 533.

[2]曹小妹，王攀，張敬敬，等.毛細(xì)管膠束電動(dòng)色譜法檢測(cè)飼料中防腐劑[J].中國(guó)飼料，2012，7：34 ～ 36.

[3]高勇，何友昭，謝海洋，等.頂空液相微萃取-膠束電動(dòng)毛細(xì)管色譜分析藥品中酯類(lèi)防腐劑[J].分析化學(xué)，2010，38（11）：1625 ～ 1628.

[4]郭嵐，謝明勇，鄢愛(ài)平，等.氣相色譜-質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定食用植物油中三種抗氧化劑[J].分析科學(xué)學(xué)報(bào)，2007，23（2）：169 ～ 172.

[5]黃濤，陳喜斌，王全利，等.酚類(lèi)飼料抗氧化劑及其構(gòu)效關(guān)系研究[J].中國(guó)飼料，2004，9：26 ～ 40.

[6]胡小鐘，余建新，錢(qián)浩明，等.油脂中九種抗氧化劑的反相高效液相色譜法分離和測(cè)定[J].分析科學(xué)學(xué)報(bào)，2000，16（1）：23 ～ 26.

[7]李興根，韓芷玲.毛細(xì)管氣相色譜法測(cè)定食品中的酚類(lèi)抗氧化劑[J].糧油食品科技，2006，14（2）：55 ～ 56.

[8]林安清，張曼，唐丹舟，等.液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)檢測(cè)飼料中多種抗氧化劑[J].分析測(cè)試學(xué)報(bào)，2007，26（增刊）：278 ～ 280.

[9]汪雋，范必威，許淑霞.固相萃取-液質(zhì)聯(lián)用法測(cè)定乳制品中對(duì)羥基苯甲酸酯[J].食品科學(xué)，2008，29（7）：328 ～ 331.

[10]楊曉鳳.凝膠滲透色譜凈化-氣相色譜法同時(shí)測(cè)定飼料中4種抗氧化劑[J].中國(guó)飼料，2011，5：38 ～ 44.

[11]張曼，何佳，林安清，等.高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定飼料中8種抗氧化劑[J].口岸衛(wèi)生控制，2006，11（5）：30 ～ 32.

[12]周建科，宋歌，劉瑞英，等.高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定化妝品中尼泊金酯類(lèi)防腐劑和特丁基對(duì)苯二酚 [J].河北大學(xué)學(xué)報(bào) （自然科學(xué)版），2010，30（4）：385 ～ 388.

[13]鄭萍，陳西平.幾種防腐劑在化妝品中的作用效果評(píng)價(jià)[J].環(huán)境與健康雜志，2008，25（2）：114 ～ 116.

[14]朱玉，李永紅.薄層色譜法測(cè)定對(duì)羥基苯甲酸酯合成產(chǎn)物中對(duì)羥基苯甲酸酯的產(chǎn)率[J].分析化學(xué)，1998，26（1）：120.

[15]Blanco E，Casais M，Mejuto M，et al.Combination of off-line solid-phase extraction and on-column sample stacking for sensitive determination of parabens and p-hydroxybenzoic acid in waters by non-aqueous capillary electrophoresis[J].Analytica Chimica Acta，2009，647：104 ～ 111.