α-半乳糖苷酶水解底物的特異性及其在保育豬日糧中的應(yīng)用

北京市營(yíng)養(yǎng)源研究所 張 波 王繼強(qiáng) 張寶彤＊

α-半乳糖苷是由一個(gè)蔗糖單位和1～4個(gè)α-半乳糖殘基通過α-1，6-糖苷鍵連接構(gòu)成的小分子低聚糖，分別生成棉子糖、水蘇糖、毛蕊花糖和筋骨草糖，通稱為棉子糖。通常，大豆籽實(shí)、脫脂大豆（Kuo 等，1988）及豆粕（Grieshop 等，2003）中含有52.4～74.4 mg/kg的α-半乳糖苷。Kuriyama和Mendel（1917）首次研究報(bào)道了α-半乳糖苷的抗?fàn)I養(yǎng)作用。單胃動(dòng)物腸道黏膜缺乏降解棉子糖的酶，這些寡糖在大腸被寄居在大腸內(nèi)的微生物發(fā)酵， 引起胃腸脹氣 （Karr-Lilienthal等，2005）。α-半乳糖苷酶主要參與棉子糖、水蘇糖、蜜二糖和半乳甘露聚糖等半乳糖苷的降解 （Brouns等，2006）。不同來源的α-半乳糖苷酶其酶學(xué)性質(zhì)不同，降解α-半乳糖苷的能力也不同。因此，研究其水解底物的特異性具有重要的意義。α-半乳糖苷酶在豬上的研究報(bào)道較少，并且日糧中添加α-半乳糖苷酶對(duì)動(dòng)物生長(zhǎng)性能影響研究結(jié)果不盡相同。因此，本試驗(yàn)研究了青霉來源α-半乳糖苷酶水解棉子糖類寡糖的特異性，并在此基礎(chǔ)上驗(yàn)證在保育豬上的應(yīng)用效果。

1 材料與方法

1.1 水解底物特異性試驗(yàn)

1.1.1 底物及試驗(yàn)用酶 蜜二糖、棉子糖和水蘇糖均購(gòu)于Sigma公司。α-半乳糖苷酶由重組青霉α-半乳糖苷酶菌株液態(tài)發(fā)酵所得，每毫升發(fā)酵上清液活性600 U。

酶活定義：在40℃、pH 5.2的條件下，每分鐘從濃度為10 mmol/L的對(duì)硝基苯基-α-D-吡喃半乳糖苷（pNPG）溶液中降解釋放1 μmol的對(duì)硝基酚所需要的酶量為1個(gè)酶活單位（U）。

1.1.2 水解反應(yīng)及產(chǎn)物的測(cè)定 1 mL濃度為1.0 mg/mL的蜜二糖、棉子糖和水蘇糖（檸檬酸-磷酸緩沖液，pH 5.2）分別與3 U的α-半乳糖苷酶液于37℃孵育16 h，同時(shí)3 U的酶液煮沸5 min滅活作為負(fù)對(duì)照。水解低聚糖釋放的半乳糖通過離子色譜（DIONEX，ICS-3000）CARBOPAC PA10高效陰離子交換柱（4 mm×250 mm）和安培計(jì)進(jìn)行檢測(cè)。流動(dòng)相是23 mmol/L NaOH，流速是1.0 mL/min。

1.2 動(dòng)物試驗(yàn)

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 72頭平均體重（12.5±0.2）kg的杜×長(zhǎng)×大公豬隨機(jī)分到12個(gè)豬圈中，每圈6頭。日糧參照《中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)——豬飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)》（2004）推薦的營(yíng)養(yǎng)需要進(jìn)行配制，日糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見表1。試驗(yàn)期為3周。日糧不添加任何抗生素，以粉料飼喂。所有豬自由采食、飲水。試驗(yàn)共設(shè)兩個(gè)處理，空白對(duì)照組飼喂基礎(chǔ)日糧，加酶組在基礎(chǔ)日糧基礎(chǔ)上添加300 U/kg的α-Gal。所用的酶是液態(tài)發(fā)酵，發(fā)酵液于4℃離心，分離得到的上清液用稻糠殼吸附，自然風(fēng)干，酶活為1200 U/g。

1.2.2 測(cè)定指標(biāo) 在試驗(yàn)第21天，所有豬以圈為單位稱重，記錄采食量，計(jì)算日增重（ADG），料重比及日采食量（ADFI）。

1.2.3 統(tǒng)計(jì)分析 試驗(yàn)數(shù)據(jù)以圈為單位進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，采用SAS（8.0）單因子方差分析，以P＜0.05為差異顯著水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 α-半乳糖苷酶水解底物的特異性 由表2和圖1可知，α-Gal對(duì)蜜二糖的降解效率最高，棉子糖以及水蘇糖也可不同程度被降解。水解反應(yīng)2 h時(shí)，蜜二糖水解釋放出的D-半乳糖占總量的60%；水解反應(yīng)4 h，蜜二糖、棉子糖和水蘇糖水解釋放的D-半乳糖量占總釋放量的80%以上。由表2可見，在實(shí)驗(yàn)室條件下，蜜二糖、棉子糖和水蘇糖水解率分別為95.7%、72.5%和32.9%。

表1 保育豬日糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平

表2 α-半乳糖苷酶的底物特異性

圖1 寡糖水解曲線

2.2 α-半乳糖苷酶對(duì)保育豬生長(zhǎng)性能的影響由表3可知，整個(gè)試驗(yàn)期豬生長(zhǎng)良好。日糧中添加300 U/kg的α-半乳糖苷酶顯著提高了保育豬平均日增重（ADG），與對(duì)照組相比，加酶組ADG提高9.76%（P=0.015）；加酶組料重比較對(duì)照組降低9.21%（P=0.020）；平均日采食量?jī)山M間無顯著性差異。

3 討論

棉子糖和水蘇糖是豆粕中含α-半乳糖苷的主要抗?fàn)I養(yǎng)因子，底物特異性試驗(yàn)結(jié)果表明，青霉來源的α-半乳糖苷酶對(duì)于天然的寡糖底物有特異性的水解作用，可以水解絕大多數(shù)蜜二糖及大部分的棉子糖，而水解水蘇糖的能力最差，其趨勢(shì)是隨著寡糖鏈長(zhǎng)度的增加水解能力逐漸減弱，這與Somiari和Balogh（1995）的報(bào)道相一致。而Manzanares等（1998）研究報(bào)道，Aniger產(chǎn)生的 α-半乳糖苷酶可以降解人工合成的底物 （pNPG）和天然的底物，如棉子糖、水蘇糖和蜜二糖，且隨著寡糖鏈長(zhǎng)度的增加，水解釋放半乳糖的能力增強(qiáng)。重組α-半乳糖苷酶水解底物的差異，其原因可能是產(chǎn)生酶的菌株不同，酶的最適pH、溫度也不同，因而降解底物的能力也有差異。不難看出，不同來源的α-半乳糖苷酶水解底物的能力不同，水解底物有選擇性。

表3 α-半乳糖苷酶對(duì)保育豬生長(zhǎng)性能的影響

通常，豆粕中α-半乳糖苷的含量為52.4～74.4 mg/g（Grieshop 等，2003）。 本試驗(yàn)中豆粕的添加量為36.4%，折合α-半乳糖苷的量約22 g/kg日糧。結(jié)合水解試驗(yàn)的結(jié)果可知，3 U的α-半乳糖苷酶經(jīng)過4 h的水解，濃度分別是1 mg/kg的蜜二糖、棉子糖和水蘇糖D-半乳糖的釋放量占總釋放量的80%以上。從理論上講，降解這3種糖最多需要66 U的α-半乳糖苷酶，但是α-半乳糖苷是一類物質(zhì)，還有痕量的毛蕊花糖（五碳糖）、六碳糖等，這些痕量的糖類的降解也會(huì)消耗一定量的酶。該酶的pH耐受性是值得考慮的問題，由于胃是酸性環(huán)境，胃內(nèi)低pH以及膽酸鹽的存在，對(duì)酶的活性有影響，部分酶活性喪失，因此，本試驗(yàn)酶的添加量為300 U/kg。

Baucells等（2000）試驗(yàn)結(jié)果表明，生長(zhǎng)豬日糧（含豆粕）中添加α-半乳糖苷酶（0.08 U/kg飼料）提高了料重比，但對(duì)增重和養(yǎng)分利用率無影響。Kim等（2003）研究證實(shí)，保育豬日糧中添加0.1%CS （混合酶，α-半乳糖苷酶活性 7 U/g、β-1，4-甘露聚糖酶活性22 U/g及微量的其他酶）飼料轉(zhuǎn)化率顯著提高9%（P＜0.05）。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，保育豬日糧中添加加α-半乳糖苷酶顯著提高了日增重和飼料轉(zhuǎn)化效率，這可能與添加α-半乳糖苷酶后食糜中的α-1，6-半乳糖苷的含量減少有關(guān)。Gdala等（1997）研究報(bào)道，保育豬日糧中添加α-半乳糖苷酶，食糜中α-1，6-半乳糖苷的含量均減少，干物質(zhì)和能量消化率分別提高2.8%和2.3%。本試驗(yàn)結(jié)果表明，對(duì)于保育豬來說，每千克日糧中添加300 U的α-半乳糖苷酶對(duì)于水解22 g的α-半乳糖苷具有積極的正效果，可以顯著提高平均日增重和飼料轉(zhuǎn)化效率。

4 結(jié)論

α-Gal可有效降解棉子糖，玉米-豆粕基礎(chǔ)日糧中添加300 U/kg的α-Gal可顯著提高保育豬平均日增重，顯著降低料重比。

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