均勻設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)優(yōu)選白毛夏枯草中總黃酮的提取工藝

涂愛(ài)國(guó)，徐國(guó)蓮

（江西中醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校，江西 撫州 344000）

現(xiàn)代研究表明，黃酮類化合物有明顯的抗氧化、抗炎、抑菌、抗癌及降血脂等生物活性，已廣泛應(yīng)用于食品和醫(yī)藥行業(yè)[1]。白毛夏枯草為唇形科植物筋骨草屬金瘡小草（Ajuga decumbens T hunb.）的全草，主要分布在秦嶺以南各省區(qū)。白毛夏枯草性味苦寒，民間主要用于止咳化痰、清熱、涼血、消腫、解毒，治療腹瀉、肝炎、疔毒癤腫、外傷出血等[2]?，F(xiàn)代藥理研究證明，白毛夏枯草具有保肝利膽、鎮(zhèn)咳、祛痰、平喘等作用[3]，其主要有效成分為黃酮。本實(shí)驗(yàn)采用均勻設(shè)計(jì)法安排實(shí)驗(yàn)，優(yōu)選出合理的總黃酮提取工藝，為生產(chǎn)工藝參數(shù)的選擇提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

DK-98-I電子恒溫水浴鍋（天津市泰斯特儀器有限公司），十萬(wàn)分之一天平（北京賽多利斯天平有限公司），TU-1901雙波長(zhǎng)紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（北京普析儀器有限公司），JJ200型電子天平（常熟市雙杰測(cè)試儀器公司），KQ-100型超聲儀（昆山市超聲波儀器廠）。

1.2 試藥

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（中國(guó)藥品生物制品檢定所）；化學(xué)試劑均為分析純；白毛夏枯草藥材于2008年7月采購(gòu)自樟樹藥材市場(chǎng)，經(jīng)江西中醫(yī)藥高等專科學(xué)校李秀英副教授鑒定為唇形科植物筋骨草屬金瘡小草（Ajuga decumbens T hunb.）。

2 方法與結(jié)果

2.1 白毛夏枯草總黃酮含量的測(cè)定

2.1.1 供試品溶液的制備 精確稱取過(guò)40目篩的白毛夏枯草藥材3份，每份10g，加100mL乙醇，采用熱回流法提取。每份平行提取兩次，過(guò)濾，合并濾液并定容至250mL容量瓶中，即得供試品溶液。

2.1.2 對(duì)照品溶液的制備 精確稱取在110℃干燥至恒重的蘆丁對(duì)照品12mg，置于50mL容量瓶中，加適量甲醇使其溶解后，加甲醇至刻度，搖勻，精確吸取20mL置于50mL容量瓶中，加水至刻度，搖勻，即得對(duì)照品溶液。

2.1.3 測(cè)定波長(zhǎng)的選擇 精確吸取對(duì)照品溶液3mL和供試品溶液0.2mL分別置于25mL刻度試管中，各加水至6mL，加5%亞硝酸鈉溶液1mL，搖勻，放置6分鐘，加10%硝酸鋁溶液1mL，搖勻，放置6分鐘，加氫氧化鈉溶液10mL，加水至刻度，搖勻，放置15分鐘，以相應(yīng)試劑為空白溶液，分別在400～700nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行掃描。結(jié)果：對(duì)照品和供試品溶液在510nm處有最大吸收，且光譜形狀極為相似，形成的絡(luò)合物在常溫下穩(wěn)定性好，滿足分光光度法測(cè)定的基本要求。因此，選定510nm作為測(cè)定波長(zhǎng)。

2.1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密量取對(duì)照品溶液1mL、2mL、3mL、4mL、5mL、6mL，分別置于25mL刻度試管中，各加水至6mL，加5%亞硝酸鈉溶液1mL，搖勻，放置6分鐘，加10%硝酸鋁溶液1mL，搖勻，放置6分鐘，加氫氧化鈉溶液10mL，加水至刻度，搖勻，放置15分鐘，以相應(yīng)試劑為空白溶液，以紫外-可見(jiàn)分光光度法在510nm的波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得到回歸方程為：A=11.48C+0.053，R=0.998，對(duì)照品蘆丁的濃度在0.0052～0.0386mg/mL范圍內(nèi)與吸光度呈良好線性關(guān)系。

2.1.5 精密度實(shí)驗(yàn) 精密量取同一供試品溶液0.5mL，按2.1.3項(xiàng)操作，平行測(cè)定5次，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為1.1%，表明該方法精密度良好。

2.1.6 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取同一供試品溶液5份，每份精密量取0.5mL，按2.1.3項(xiàng)操作，測(cè)定，RSD為1.5%，表明該方法重現(xiàn)性良好。

2.1.7 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 在室溫條件下，精密吸取同一供試品溶液，在0小時(shí)、2小時(shí)、4小時(shí)、6小時(shí)、8小時(shí)內(nèi)分別測(cè)定A值，分別為0.589、0.599、0.594、0.596、0.590，計(jì)算其 RSD為 0.3%，說(shuō)明供試品溶液在8小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.8 回收率實(shí)驗(yàn) 精密吸取已知總黃酮含量的同一供試品溶液0.5mL，取5份，分別精密加入對(duì)照品溶液適量，按2.1.3項(xiàng)操作測(cè)定吸光度，得出總黃酮含量，計(jì)算出加樣回收率。結(jié)果，平均回收率為94.2%，RSD為1.6%，表明該法回收率良好。

2.2 均勻設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)

均勻設(shè)計(jì)法由方開(kāi)泰研究員和數(shù)學(xué)家王元在1978年共同提出，它是將數(shù)學(xué)論和多元統(tǒng)計(jì)相結(jié)合的一種新穎的實(shí)驗(yàn)方法，其核心思想是用確定性方法尋找空間中均勻分布的點(diǎn)集來(lái)代替Monte carlo中的隨機(jī)數(shù)，它通過(guò)提高實(shí)驗(yàn)點(diǎn)“均勻分散”的程度，使實(shí)驗(yàn)點(diǎn)具有更好的代表性及能用較少的實(shí)驗(yàn)獲得較多的信息。

2.2.1 因素水平及指標(biāo)的確定 采用乙醇回流提取白毛夏枯草總黃酮，主要影響因素為乙醇濃度（%）、料液比、提取時(shí)間（h）3個(gè)因素，故以此三因素為參考水平，共設(shè)9個(gè)水平進(jìn)行均勻設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，優(yōu)選最佳提取條件。用U9（93）均勻設(shè)計(jì)表安排實(shí)驗(yàn)，以總黃酮含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)。因素水平見(jiàn)表1。

2.2.2 實(shí)驗(yàn)安排及結(jié)果 按2.1.1項(xiàng)方法制備供試品溶液，分別精密吸取1～9號(hào)各0.5mL，按2.1.3項(xiàng)操作。測(cè)定其在510nm處吸光度A。由回歸方程計(jì)算出總黃酮含量，并進(jìn)行方差分析。均勻設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)安排及結(jié)果見(jiàn)表2，方差分析結(jié)果見(jiàn)表3。

將表3數(shù)據(jù)輸入計(jì)算機(jī)，通過(guò)王玉方“均勻設(shè)計(jì)”3.00軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，采用逐步回歸（后退法）進(jìn)行多元線性回歸處理，得多個(gè)多元回歸方程，最后優(yōu)選確定回歸方程為Y=-0.924+0.0267A+0.0527B+0.0941C。由表 3可知，F(xiàn)=10.86，P<0.05，回歸方程在α=0.05水平上有顯著意義，通過(guò)計(jì)算方程中各項(xiàng)對(duì)回歸的貢獻(xiàn):C>B>A。依據(jù)回歸方程和實(shí)際經(jīng)驗(yàn)，選擇白毛夏枯草中總黃酮的提取工藝為料液比1∶25，乙醇濃度80%，提取時(shí)間兩小時(shí)，總黃酮含量預(yù)期值為4.86%。

2.2.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 根據(jù)優(yōu)化工藝進(jìn)行總黃酮的提取，制備3批樣品，測(cè)定其中總黃酮含量，見(jiàn)表4。得平均值Y=4.69%，與理論推測(cè)值相近，在其范圍區(qū)間內(nèi)。

3 討論

均勻設(shè)計(jì)法在條件范圍變化大而需要進(jìn)行多水平實(shí)驗(yàn)的情況下，可極大地減少實(shí)驗(yàn)的次數(shù)，它只需要與因素水平數(shù)相等次數(shù)的q次實(shí)驗(yàn)即可獲得正交設(shè)計(jì)的至少做q2次實(shí)驗(yàn)所能獲得的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。均勻設(shè)計(jì)只考慮實(shí)驗(yàn)點(diǎn)在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)充分“均勻散點(diǎn)”，而不考慮“整齊可比”，因此實(shí)驗(yàn)的結(jié)果沒(méi)有正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果的整齊可比性，其實(shí)驗(yàn)結(jié)果的處理多采用回歸分析方法。均勻設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)不僅能找到最優(yōu)的實(shí)驗(yàn)條件組合，還能建立可定量描述指標(biāo)和因素間關(guān)系的數(shù)學(xué)模型[4]。

通過(guò)均勻設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析，確定提取次數(shù)為影響白毛夏枯草總黃酮提取率的主要因素，影響顯著;而溶劑用量和乙醇濃度對(duì)白毛夏枯草總黃酮提取率的影響很小，不顯著。最后確定最佳提取工藝為料液比1∶25，乙醇濃度80%，提取時(shí)間2小時(shí)。均勻設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)果與預(yù)測(cè)結(jié)果基本接近，表明該提取工藝穩(wěn)定、可行。

表1 因素水平

表2 均勻設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)安排及結(jié)果

表3 方差分析

表4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n=3）

[1]許瑞波，曹曉英，王明艷.睡蓮葉黃酮的提取及其抑菌活性研究[J].食品科技，2009，34（4）：190-197.

[2]南京中醫(yī)藥大學(xué).中藥大辭典[M].2版.上?！蒙虾？茖W(xué)技術(shù)出版社，2006.

[3]馬志平，黃榕.筋骨草有效部位黃酮類粗品的保肝試驗(yàn)[J].海峽藥學(xué)，2002，14（5）：40-41.

[4]方開(kāi)泰.均勻設(shè)計(jì)——數(shù)論方法在試驗(yàn)設(shè)計(jì)的應(yīng)用[J].應(yīng)用數(shù)學(xué)學(xué)報(bào)，1980，3（4）：363.