貞芪酪蛋白肽藥物血清對Hela細(xì)胞生長增殖的影響

楊家齊，張延英，朱建坤，吳建軍，舒 暢

（1.大唐八0三發(fā)電廠衛(wèi)生院，甘肅 蘭州 732800；2.甘肅中醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730000）

貞芪酪蛋白復(fù)合肽是根據(jù)“扶正培本、扶正祛邪”的祖國醫(yī)學(xué)理論，以黃芪、女貞子及酪蛋白復(fù)合肽等組方經(jīng)特定制劑工藝研制而成。該方劑符合中醫(yī)組方原則，是針對惡性腫瘤的發(fā)病機(jī)制而研制的。酪蛋白復(fù)合多肽在保健品、醫(yī)藥等多領(lǐng)域起著特殊的作用。近年來，肽在人體中的作用已引起科學(xué)界的高度重視，大量研究結(jié)果表明，蛋白質(zhì)攝入后，并不能完全水解成氨基酸，而是大部分以肽的形式被吸收；其藥物血清可抑制人肝癌細(xì)胞的增殖，顯著降低細(xì)胞核質(zhì)比，抑制細(xì)胞分泌AFP，降低細(xì)胞γ-GT活性，升高ALP活性，并有顯著抑制人肝癌細(xì)胞端粒酶活性的作用[1]，其含藥血清對人肺腺癌細(xì)胞A549有一定抑制作用[2]。本文通過體外抑制Hela細(xì)胞，探討貞芪酪蛋白肽含藥血清抗腫瘤功能及作用機(jī)理。

1 材料

1.1 動(dòng)物

SD雄性大鼠30只，體重200～300g，SPF級，購自甘肅中醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號：SCXK（甘）2011-0001，制備藥物血清用；制備藥物血清的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)在甘肅中醫(yī)學(xué)院SPF級動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)施使用證編號：SYXK（甘）2011-0001。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

用含10%新生牛血清和青/鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，于37℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)HeLa細(xì)胞株。待單層細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)皿后，用0.25%的胰蛋白酶消化傳代，取對數(shù)生長期的細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 藥物與試劑

貞芪酪蛋白復(fù)合肽（LACP）由黃芪、女貞子和酪蛋白復(fù)合肽組成。中藥購自蘭州市黃河藥材公司，酪蛋白復(fù)合肽由蘭州同健生物公司提供。注射用環(huán)磷酰胺（國藥準(zhǔn)字H32020857），由江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司生產(chǎn)，RPMI1640培養(yǎng)基、新生牛血清、MTT購自蘭州生升醫(yī)藥科技有限責(zé)任公司。

1.4 儀器設(shè)備

全自動(dòng)酶標(biāo)儀，美國伯樂公司生產(chǎn)；倒置顯微鏡，日本OLYMPUS公司生產(chǎn)，型號ZX-71-22PH/FL；CO2培養(yǎng)箱，日本SANYO公司生產(chǎn)，型號MCO-15AC；生物安全柜，香港HFsafe公司生產(chǎn)，型號760S。

2 方法與結(jié)果

2.1 藥物血清的制備

參照文獻(xiàn)方法[3]。取30只大鼠分為空白血清組（靜脈點(diǎn)滴蒸餾水）、陽性藥環(huán)磷酰胺組（200mg/kg）、LACP含藥血清組（1.0g/mL·200g-1）。陽性藥組環(huán)磷酰胺灌胃，每次給藥200mg/mL·kg-1），LACP 提取液灌胃，每次給藥 1.0g/mL·200g-1），兩次/天；對照組給同體積蒸餾水，每組10只，連續(xù)3天，第4天一次給予全日劑量1h后，戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，無菌條件下從大鼠股靜脈采血，靜置3～4h，于4℃，3000r/min離心20min，分離血清。將同一組大鼠的血清混勻，56℃滅活30min，4℃保存?zhèn)溆?。用不含血清?640溶液稀釋成40%、20%，分別過濾，于-20℃保存。

2.2 含藥血清對Hela細(xì)胞的抑制作用[4]

采用MTT法。取對數(shù)生長期的Hela細(xì)胞，4×103/mL接種于96孔板中，培養(yǎng)24h后加入含藥血清，每孔200μL，含藥血清終末濃度為20%、10%。用同濃度空白血清作對照，繼續(xù)培養(yǎng)至48h，然后分別加入MTT溶液（5mg/mL，生理鹽水配制）。繼續(xù)培養(yǎng)4h，于3×103r/min離心10min，棄上清液，加入DMSO 200μL，輕振10min后用酶標(biāo)儀測A550。做組間t檢驗(yàn)，并計(jì)算抑制率。全自動(dòng)酶標(biāo)儀測定各孔A值，按如下公式計(jì)算抑制率，抑制率=（對照組A均值-實(shí)驗(yàn)組A均值/對照組A均值）×100%。

2.3 統(tǒng)計(jì)方法

2.4 結(jié)果

LACP灌胃給藥后，分離的小鼠血清對Hela細(xì)胞有抑制作用。LACP 20%、10%含藥血清組與空白血清組比較，均具有極顯著性差異（P＜0.01），與環(huán)磷酰胺組血清比較，也具有極顯著性差異（P＜0.01），說明LACP含藥血清在體外具有一定的抗Hela細(xì)胞增殖的作用（見表1）。

表1 LACP大鼠含藥血清對Hela細(xì)胞的影響（n=10）

3 討論

腫瘤的發(fā)生是多種基因的異常表達(dá)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的結(jié)果，因此，有效控制腫瘤細(xì)胞的異常凋亡是治療腫瘤的有效途徑；利用體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)行藥物篩選具有簡便、經(jīng)濟(jì)、可行等優(yōu)點(diǎn)，因而被普遍采用；隨著分子腫瘤學(xué)研究的不斷深入，含藥血清的體外抗腫瘤實(shí)驗(yàn)已成為抗腫瘤藥物篩選過程中必不可少的一部分[5]。近年來，從傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中發(fā)掘新的抗癌藥物用于腫瘤治療已成為趨勢，中藥的抗癌效應(yīng)正受到越來越多的關(guān)注。惡性腫瘤屬于中醫(yī)學(xué)，積聚、噎嗝、虛勞、乳巖等范疇，其病機(jī)主要是瘀血內(nèi)停、痰濕停聚、氣血陰陽虧虛，治則主要為活血化瘀、燥濕化痰、清熱解毒、扶正固本、以毒攻毒等。中藥是我國治療腫瘤的傳統(tǒng)方法，中藥治療疾病的主要方法是復(fù)方，因中藥復(fù)方是一個(gè)有機(jī)整體，可互增療效，以最大限度地治療疾病。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：LACP含藥血清對Hela細(xì)胞有一定抑制作用，初步顯示的劑量反應(yīng)關(guān)系進(jìn)一步證明其具有抗Hela腫瘤細(xì)胞作用，其中，20%含藥血清對Hela細(xì)胞抑制率為53.09%，10%含藥血清的抑制率為35.60%，顯示出良好的體外抑癌效果，與環(huán)磷酰胺組血清比較，也具有極顯著性差異。黃芪、女貞子作為一種傳統(tǒng)中藥，傳統(tǒng)上就用于腫瘤的輔助治療，通過我們的研究，也有可能用于宮頸癌的化療，但其抗腫瘤的確切機(jī)制及臨床應(yīng)用劑量和療效等還需做深入研究。

[1]張延英，朱建坤，吳建軍，等.貞芪酪蛋白肽藥物血清誘導(dǎo)Bel-7402細(xì)胞分化的體外實(shí)驗(yàn)研究 [J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2008，14（9）：47-50.

[2]張延英，吳建軍，王鵬善，等.貞芪酪蛋白肽復(fù)合物血清對人肺腺癌A549細(xì)胞分化抑制作用及相關(guān)機(jī)制研究[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2010，16（4）：114-117.

[3]劉平，周建鋒，胡義揚(yáng)，等.益氣養(yǎng)陰誘導(dǎo)SMMC-7721肝癌細(xì)胞分化作用與意義[J].中國中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志，2000，6（8）：29-33.

[4]孟李，王寧生.含藥血清的制備方法研究[J].中藥新藥與臨床藥理，1999，10（5）：290.

[5]Lampertico P，Malter JS，Gerber MA.Development and application of an in vitro model for screening anti－h(huán)epatitis B virus therapeutics[J].Hepatology，1991，13（3）：422－426.