HPLC法同時(shí)測(cè)定雙氯達(dá)克乳膏中2種主藥及防腐劑的含量

陳紅君，干志彬，沈鳴，袁杰，余自成#（.同濟(jì)大學(xué)附屬楊浦醫(yī)院/上海市楊浦區(qū)中心醫(yī)院臨床藥學(xué)與藥理學(xué)研究室，上海 0009；.上海市腫瘤研究所，上海 0003）

雙氯達(dá)克乳膏為我院自制制劑，由氯霉素、丙酸氯倍他索等與乳膏基質(zhì)混勻制成，臨床上用于治療神經(jīng)性皮炎、銀屑病、濕疹和各種瘙癢等，療效確切。制劑中所用的羥苯乙酯為尼泊金酯類化合物，是一類很有效的防腐劑，普遍應(yīng)用于醫(yī)院制劑的軟膏和液體制劑處方中。近年來(lái)國(guó)外研究顯示其在臨床上有多種不良反應(yīng)，尤以過(guò)敏反應(yīng)多見(jiàn)[1-2]。醫(yī)院外用乳膏劑中其常用量為0.1%[3]，有報(bào)道[4]建議羥苯乙酯用量可控制在0.03%～0.06%，以降低其不良反應(yīng)發(fā)生幾率。因此醫(yī)藥學(xué)工作者應(yīng)控制這類防腐劑的處方含量在適宜水平，不宜高于目前的常用含量。為此，筆者建立了高效液相色譜（HPLC）法同時(shí)測(cè)定雙氯達(dá)克乳膏中氯霉素、丙酸氯倍他索及羥苯乙酯的含量，以控制制劑質(zhì)量，研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料

1.1 儀器

HPLC系統(tǒng)，包括1525二元泵、2489紫外檢測(cè)器、2707自動(dòng)進(jìn)樣器、智能柱溫箱、BreezeTMSoftware色譜工作站（美國(guó)Waters公司）；MS204S型電子分析天平（瑞士梅特勒公司）；DK-S22型電熱恒溫水浴鍋（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；超純水儀（美國(guó)Millipore公司）。

1.2 藥品與試劑

氯霉素對(duì)照品（批號(hào)：130303-200614，純度：99.3%）、丙酸氯倍他索對(duì)照品（批號(hào)：100302-200602，純度：99.8%）、醋酸氟輕松對(duì)照品（內(nèi)標(biāo)，批號(hào)：100010-201108，純度：99.6%，使用前105℃干燥2h）均來(lái)源于中國(guó)食品藥品檢定研究院；羥苯乙酯對(duì)照品（廣東省臺(tái)山市新寧制藥廠，批號(hào)：20100701，純度：100.1%）；雙氯達(dá)克乳膏（批號(hào)：2012001、2012002、2012003，規(guī)格：每盒20g，含氯霉素0.2g、丙酸氯倍他索0.01g、羥苯乙酯0.02g）及不含主成分的空白基質(zhì)均由我院制劑室制備；試驗(yàn)用水均為超純水，甲醇為色譜純，磷酸二氫鉀為分析純。

2 方法與結(jié)果[5-6]

2.1 溶液的制備

2.1.1 對(duì)照品混合溶液的制備。精密稱取對(duì)照品氯霉素250.0mg、丙酸氯倍他索50.0mg、內(nèi)標(biāo)7.5mg、羥苯乙酯25.0mg，分別置于25ml量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，制成質(zhì)量濃度分別為10.0、2.0、0.3、1.0mg/ml的對(duì)照品貯備液。分別精密量取除內(nèi)標(biāo)貯備液外的對(duì)照品貯備液適量，置于25ml量瓶中，再加入內(nèi)標(biāo)貯備液1.25ml，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即制成含氯霉素0.4mg/ml、丙酸氯倍他索0.02mg/ml、羥苯乙酯0.04mg/ml，并含內(nèi)標(biāo)0.015mg/ml的對(duì)照品混合溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備。精密稱取雙氯達(dá)克乳膏1g（約含氯霉素10mg、丙酸氯倍他索0.5mg、羥苯乙酯1mg），置于25ml量瓶中，精密加內(nèi)標(biāo)溶液1.25ml，加甲醇約20ml，于70℃水浴中加熱10min，小心搖蕩使主藥盡量溶解；放冷，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，置于冰浴中冷卻2h以上，取出后用0.45μm微孔濾膜迅速濾過(guò)，續(xù)濾液放冷，即得供試品溶液?？瞻谆|(zhì)由不含3個(gè)被測(cè)組分的其他組分按處方比例制得，同法處理得空白基質(zhì)試液。

2.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

取丙酸氯倍他索（0.02mg/ml）、氯霉素（0.02mg/ml）、羥苯乙酯（0.008mg/ml）3溶液進(jìn)行掃描，光譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 3組分的紫外吸收光譜圖Fig 1 UV spectrums of 3components

由圖1可見(jiàn)，丙酸氯倍他索、羥苯乙酯及氯霉素的最大吸收波長(zhǎng)分別為240、256、277nm，同質(zhì)量濃度丙酸氯倍他索與氯霉素的最大吸收強(qiáng)度相當(dāng)，0.008mg/ml的羥苯乙酯的最大吸收強(qiáng)度比其他2種組分的最大吸收強(qiáng)度高，加之樣品中3種組分含量之比為氯霉素-羥苯乙酯-丙酸氯倍他索＝20∶2∶1，鑒于丙酸氯倍他索量最低，最大吸收較弱，此組分測(cè)定波長(zhǎng)選擇240nm為佳。筆者曾試驗(yàn)0～6min使用270nm、6～14min使用240nm的雙波長(zhǎng)檢測(cè)，但由于波長(zhǎng)差距較大，轉(zhuǎn)化后基線漂移較大，導(dǎo)致內(nèi)標(biāo)峰形不好，丙酸氯倍他索含量測(cè)定準(zhǔn)確度不理想；且雙波長(zhǎng)檢測(cè)對(duì)儀器要求較高，影響方法的適用性。最終本文選定240nm為3種組分共同檢測(cè)的波長(zhǎng)。

2.3 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：XBrigeTMC18（250mm×4.6mm，5μm）；流動(dòng)相：0.02mol/L磷酸二氫鉀-甲醇（35∶65），流速：1.0ml/min；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)：240nm；進(jìn)樣量：20μl；柱溫：40℃；靈敏度：0.002AUFS。取“2.1”項(xiàng)下對(duì)照品混合溶液、供試品溶液和空白基質(zhì)試液進(jìn)樣分析。結(jié)果在該色譜條件下，氯霉素、羥苯乙酯、內(nèi)標(biāo)及丙酸氯倍他索的色譜峰形良好，保留時(shí)間分別為3.46、4.44、9.63、13.35min，4種組分的理論板數(shù)均大于2800，分離度均大于3.7，基質(zhì)不干擾主成分的測(cè)定，色譜圖見(jiàn)圖2。

圖2 高效液相色譜圖A.空白基質(zhì)試液；B.對(duì)照品混合溶液；C.供試品溶液；1.氯霉素；2.羥苯乙酯；3.內(nèi)標(biāo)；4.丙酸氯倍他索Fig 2 HPLC chromatogramsA.blank matrix solution；B.mixed solution of substance control；C.test sample solution；1.chloramphenicol；2.ethylparaben；3.internal standard；4.clobetasol propionate

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

分別精密量取除內(nèi)標(biāo)溶液外的對(duì)照品貯備液適量，置于25ml量瓶中，再各加入內(nèi)標(biāo)貯備液1.25ml，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成一系列不同質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液（氯霉素為0.11、0.22、0.56、1.11、2.22mg/ml，丙酸氯倍他索為 0.005、0.01、0.028、0.056、0.11mg/ml，羥苯乙酯為 0.01、0.02、0.056、0.11、0.22mg/ml），進(jìn)樣測(cè)定。氯霉素與羥苯乙酯分別按外標(biāo)法以色譜峰面積（y）對(duì)質(zhì)量濃度（x）進(jìn)行線性回歸，丙酸氯倍他索按內(nèi)標(biāo)法以丙酸氯倍他索與內(nèi)標(biāo)峰面積之比（y）對(duì)質(zhì)量濃度（x）進(jìn)行線性回歸，結(jié)果見(jiàn)表1。

2.5 精密度試驗(yàn)

表1 3種組分的線性關(guān)系（n＝5）Tab 1Linear ranges of 3components（n＝5）

取對(duì)照品混合溶液適量，分別在同日內(nèi)重復(fù)進(jìn)樣5次，測(cè)定其峰面積；另連續(xù)測(cè)定5d，每日進(jìn)樣1次。結(jié)果，氯霉素、丙酸氯倍他索、內(nèi)標(biāo)、羥苯乙酯的日內(nèi)RSD分別為0.63%、0.97%、0.83%、0.87%（n＝5），日間 RSD 分別為 1.09%、1.26%、0.89%、0.95%（n＝5）。

2.6 回收率試驗(yàn)

取空白基質(zhì)1g，精密稱定，共9份，按處方比例精密加入低、中、高不同量的氯霉素、丙酸氯倍他索和羥苯乙酯對(duì)照品，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定。以標(biāo)準(zhǔn)曲線定量各被測(cè)組分，回收率試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝9）Tab 2Results of recovery tests（n＝9）

2.7 樣品含量測(cè)定

精密稱取雙氯達(dá)克乳膏1g（約含氯霉素10mg，丙酸氯倍他索0.5mg，羥苯乙酯1mg）置于25ml量瓶中，精密加內(nèi)標(biāo)溶液1.25ml，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定。氯霉素和羥苯乙酯按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算含量，丙酸氯倍他索以內(nèi)標(biāo)法計(jì)算含量。樣品中3組分含量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 樣品含量測(cè)定結(jié)果（n＝4）Tab 3Results of content determination of samples（n＝4）

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取供試品溶液適量，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件，分別于第0、1、2、4、6、8、12h進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算。結(jié)果，供試品中氯霉素、丙酸氯倍他索及羥苯乙酯的RSD分別為0.59%、0.87%及0.89%，表明供試品溶液在12h內(nèi)穩(wěn)定。

3 討論

3.1 色譜柱的選擇

本試驗(yàn)曾測(cè)試了色譜柱XBrigeTMC18（250mm×4.6mm，5μm）與Symmetry?C18（75mm×4.6mm，3.5μm）的分析效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)采用前種色譜柱，被測(cè)組分的分離度效果較好，且無(wú)重疊峰，因此選擇前者為分析色譜柱。

3.2 流動(dòng)相體積比與柱溫的優(yōu)化

為得到最快的分析速度和最好的分離度，本試驗(yàn)比較了0.02mol/L磷酸二氫鉀-甲醇流動(dòng)相在30∶70、35∶65和40∶60不同體積比下的測(cè)定結(jié)果。結(jié)果顯示體積比為30∶70時(shí)，組分迅速洗脫，但分離度和峰形均不理想；而40∶60體積比下，各組分峰分離度良好，但洗脫時(shí)間太長(zhǎng)；當(dāng)體積比為35∶65時(shí)，洗脫時(shí)間、峰形得以兼顧，且峰2與峰1、峰3與峰2、及峰4與峰3之間的分離度分別為3.8、7.3及6.8，均與雜質(zhì)達(dá)到基線分離（見(jiàn)圖2C）。同時(shí)，本試驗(yàn)比較了30℃柱溫和40℃柱溫對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在35∶65流動(dòng)相體積比、40℃柱溫條件下，各組分洗脫時(shí)間、峰形和分離度都達(dá)到最理想的情況。

3.3 樣品處理工藝的優(yōu)化

為使被測(cè)組分在測(cè)定前充分從樣品中提取出來(lái)，筆者測(cè)試了甲醇直接超聲溶解、少量氯仿大量甲醇超聲溶解后直接濾過(guò)進(jìn)樣的方法，發(fā)現(xiàn)超聲不能使樣品溶解，且進(jìn)樣后峰形欠佳。又考察了甲醇以不同溫度（60、70、80℃）溶解樣品，溶解后冰浴不同時(shí)間（0、30、60、90、120min與8h）后過(guò)濾進(jìn)樣，同時(shí)考察了樣品稀釋倍數(shù)（1g至10ml、1g至25ml、1g至50ml、1g至100ml）的影響，結(jié)果回收率以1g樣品用25ml甲醇70℃溶解、冰浴2h以上時(shí)最接近100%。

3.4 方法的確定

雙氯達(dá)克乳膏是醫(yī)院制劑，目前只有1篇報(bào)道用HPLC法同時(shí)測(cè)定其中氯霉素與丙酸氯倍他索的含量[6]。經(jīng)本試驗(yàn)驗(yàn)證該方法均用外標(biāo)法測(cè)定氯霉素與丙酸氯倍他索，由于兩者含量相差20倍，如果均用外標(biāo)法測(cè)定穩(wěn)定性不理想，測(cè)試樣品含量結(jié)果易偏高。故本文以該法為基礎(chǔ)優(yōu)化了色譜條件、樣品處理方法及工藝，參考《中國(guó)藥典》[5]引入醋酸氟輕松為丙酸氯倍他索內(nèi)標(biāo)，使結(jié)果穩(wěn)定、準(zhǔn)確度更高，且可以同時(shí)測(cè)定2種主藥及防腐劑羥苯乙酯的含量。在本方法色譜條件下，幾種被測(cè)組分達(dá)到基線分離、峰形好、分離度高，準(zhǔn)確度及回收率均符合要求，各試驗(yàn)中RSD均＜2%。故本方法可以更好地控制雙氯達(dá)克乳膏的質(zhì)量。

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[5] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典：二部[S].2010年版.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：102、1031.

[6] 袁杰，張琳，黃雄偉，等.HPLC法同時(shí)測(cè)定雙氯達(dá)克乳膏中氯霉素和丙酸氯倍他索的含量[J].中國(guó)藥房，2010，21（1）：78.