復(fù)方硫磺洗劑微生物限度檢查方法的建立

王海華（南寧食品藥品檢驗所，南寧 530001）

復(fù)方硫磺洗劑處方由升華硫、硫酸鋅、樟腦醑、甘油、甲基纖維素等組成，制劑中硫磺與皮膚分泌物作用生成硫化物，能使表皮軟化，并有脫脂、殺菌、止癢以及抑制角質(zhì)形成作用；硫酸鋅具有輕度殺菌以及收斂作用；樟腦具有局部止痛、止癢的效果。該洗劑可用于治療疥瘡、體癬、手足癬、腳氣等，為外用藥。

在對具有抗菌活性的藥品進(jìn)行微生物限度檢查時，應(yīng)首先消除其抗菌活性，并通過試驗驗證是否徹底去除抗菌活性，以保證檢驗結(jié)果的有效性。薄膜過濾法是消除藥品中抗菌活性的最有效方法，但由于復(fù)方硫磺洗劑處方中升華硫不溶于水，使得無法簡單地采用水溶液作為沖洗劑去除抗菌活性。筆者在試驗中發(fā)現(xiàn)，在薄膜過濾法中以聚山梨酯80作為增溶劑，可有效去除復(fù)方硫磺洗劑的抑菌作用。據(jù)此，筆者建立了通過薄膜過濾結(jié)合在沖洗液中加入聚山梨酯80的方法，對復(fù)方硫磺洗劑進(jìn)行了微生物限度檢查；并按2010年版《中國藥典》（二部）規(guī)定的方法[1]對復(fù)方硫磺洗劑微生物限度檢查方法進(jìn)行了驗證，以確定該制劑所用微生物限度檢查方法的有效可行。

1 材料

1.1 儀器

LRH-250-G型光照培養(yǎng)箱、LRH-250-A型生化培養(yǎng)箱（廣東省醫(yī)療器械廠）；HR-8753GM微波爐（青島海爾微波制品有限公司）；Ⅱ級生物安全柜（上海振梓創(chuàng)空氣凈化設(shè)備有限公司）。

1.2 藥品

復(fù)方硫磺洗劑（廣西中醫(yī)學(xué)院瑞康醫(yī)院制劑室，批號：090218、090303、090316，規(guī)格：每瓶 200ml，含硫磺 0.03g/ml）。

1.3 菌種

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）[CMCC（B）63501]、金黃色葡萄球菌（Staphlococcus aureus）[CMCC（B）26003]、大腸埃希菌（Escherichia coli）[CMCC（B）44102]、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）[CMCC（B）10104]、白色念珠菌（Candida albicans）[CMCC（F）98001]、黑曲霉（Aspergillus niger）[CMCC（F）98003]均來自中國醫(yī)學(xué)細(xì)菌保藏管理中心。

1.4 培養(yǎng)基及稀釋劑、增溶劑

營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（批號：090226）、玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基（批號：090318）、膽鹽乳糖培養(yǎng)基（BL，批號：090529）、蛋白胨（批號：090617）均來源于廣西食品藥品檢驗所；營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（批號：090518）、溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基（批號：090601）均來源于北京三藥科技開發(fā)公司；改良馬丁培養(yǎng)基（批號：090302）、甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基（批號：090311）均來源于北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司；適用性檢查符合2010年版《中國藥典》的相關(guān)規(guī)定。pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液、0.1%蛋白胨水溶液、含0.1%聚山梨酯80的0.1%蛋白胨水溶液、0.9%無菌氯化鈉溶液等為自制。

2 方法與結(jié)果

參照2010年版《中國藥典》（二部）微生物限度檢查法[1]進(jìn)行試驗，簡述如下：

2.1 菌液的制備

接種金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸埃希菌和銅綠假單胞菌的新鮮培養(yǎng)物至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，30～35℃培養(yǎng)18～24h；接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁培養(yǎng)基中，23～28℃培養(yǎng)24～48h。上述培養(yǎng)物用0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1ml含菌數(shù)為50～100CFU的菌懸液。接種黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基中，23～28℃培養(yǎng)5～7d，加入3～5ml 0.9%無菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫。吸出孢子懸液至無菌試管內(nèi)，用0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1ml含孢子數(shù)為50～100CFU的孢子懸液。

2.2 供試液制備

取供試品10ml，加pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液稀釋至100ml，制備成均勻的1∶10的供試液，靜置5min，取上清液備用。

2.3 微生物限度檢查方法

2.3.1 平皿法：取1∶10的供試液1ml注入平皿。

2.3.2 培養(yǎng)基稀釋法：取1∶10的供試液1ml，注入5個平皿，每個平皿0.2ml。

2.3.3 薄膜過濾法：取1∶10的供試液10ml，采用薄膜過濾法，分別以0.1%蛋白胨水溶液（A）及含0.1%聚山梨酯80的0.1%蛋白胨水溶液（B）為沖洗液。沖洗量：A 100、200、300、400、500、600、700、800ml，B 100、200ml。

2.4 細(xì)菌、霉菌和酵母菌檢查方法學(xué)驗證試驗

2.4.1 試驗組：按“2.3”項下方法操作后，分別將50～100CFU/ml的試驗菌1ml，注入同一平皿中（n＝3），立即傾注瓊脂培養(yǎng)基，待凝固后置于規(guī)定溫度，細(xì)菌培養(yǎng)24～48h，白色念珠菌和黑曲霉培養(yǎng)48～72h，測定其菌數(shù)；薄膜過濾法時，取供試液過濾、沖洗，在最后一次沖洗液中加入試驗菌1ml，過濾，按薄膜過濾法測定其菌數(shù)。

2.4.2 菌液組：取試驗菌1ml注入平皿中（n＝3），立即傾注瓊脂培養(yǎng)基，待凝固后置于規(guī)定溫度，細(xì)菌培養(yǎng)24～48h，白色念珠菌和黑曲霉培養(yǎng)48～72h，測定所加入的試驗菌數(shù)；薄膜過濾法時，取供試液過濾，沖洗，在最后一次沖洗液中加入試驗菌1ml，過濾，按薄膜過濾法測定其菌數(shù)。

2.4.3 供試品對照組：按“2.3”項下相應(yīng)方法操作后，立即傾注瓊脂培養(yǎng)基，待凝固后置于規(guī)定溫度，細(xì)菌培養(yǎng)24～48h，白色念珠菌和黑曲霉培養(yǎng)48～72h，測定供試品本底菌數(shù)；薄膜過濾法時，取供試液過濾，沖洗，按薄膜過濾法測定其菌數(shù)。

2.4.4 回收率的計算：試驗組的加菌回收率＝（試驗組平均菌落數(shù)－供試品對照組平均菌落數(shù)）/（菌液組的平均菌落數(shù)）×100%。

試驗結(jié)果表明，本品采用平皿法、培養(yǎng)基稀釋法、薄膜過濾法[A，即以0.1%蛋白胨水溶液為沖洗液（沖洗量100、200、300、400、500、600、700、800ml）進(jìn)行檢驗，枯草芽孢桿菌的回收率均小于70.0%]；采用薄膜過濾法[B，即以含0.1%聚山梨酯80的0.1%蛋白胨水溶液為沖洗液（沖洗量為每膜200ml）]進(jìn)行檢驗，枯草芽孢桿菌的回收率均＞85.0%。而大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌、黑曲霉采用培養(yǎng)基稀釋法（每皿0.2ml）測定，回收率均＞80.0%，結(jié)果詳見表1。3批樣品5種試驗菌采用薄膜過濾法（B），回收率均＞85.0%，結(jié)果見表2。

表1 不同方法回收率結(jié)果（n＝3）Tab 1Recovery rate by different methods（n＝3）

表2 3批樣品薄膜過濾法（B）回收率結(jié)果（n＝3）Tab 2 Recovery rate of membrane filtration method（B）for 3batches of samples（n＝3）

2.5 控制菌檢查驗證試驗

2.5.1 金黃色葡萄球菌：取上述1∶10的供試液10ml加入至相應(yīng)100、200、300ml的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中（共2組），同時一組接種金黃色葡萄球菌10～100CFU作為試驗組，另一組接種大腸埃希菌10～100CFU作為陰性菌對照組，35℃培養(yǎng)24h。結(jié)果，試驗組、陰性菌對照組的營養(yǎng)肉湯均呈現(xiàn)渾濁。分別取培養(yǎng)物劃線接種于甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基平板上，35℃培養(yǎng)24～72h，結(jié)果陰性菌對照組100、200、300ml及試驗組100、200ml在平板上均未見菌落生長，試驗組300ml在平板上有金黃色葡萄球菌典型菌落生長，結(jié)果見表3。

表3 金黃色葡萄球菌驗證試驗結(jié)果Tab 3 Results of validation tests for Staphlococcus aureus

從表3可得出，采用培養(yǎng)基稀釋法（培養(yǎng)基300ml），陰性菌對照組未檢出陰性對照菌，試驗組檢出試驗菌。表明金黃色葡萄球菌可采用此法進(jìn)行控制。

2.5.2 銅綠假單胞菌：取上述1∶10的供試液10ml加入至100ml BL培養(yǎng)基中（共2組），同時一組接種銅綠假單胞菌10～100CFU作為試驗組，另一組接種大腸埃希菌10～100CFU作為陰性菌對照組，35℃培養(yǎng)18～24h。結(jié)果，試驗組、陰性菌對照組的BL均呈現(xiàn)渾濁。分別取培養(yǎng)物劃線接種于溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基平板上，35℃培養(yǎng)18～24h，結(jié)果陰性菌對照組在平板上未見菌落生長，試驗組在平板上有銅綠假單胞菌典型菌落生長，結(jié)果表明銅綠假單胞菌可采用常規(guī)法進(jìn)行控制，詳見表4。

表4 銅綠假單胞菌驗證試驗結(jié)果Tab 4 Results of validation tests for Pseudomonas aeruginosa

2.6 驗證試驗結(jié)果

按上述建立的復(fù)方硫磺洗劑微生物限度檢查法，細(xì)菌數(shù)采用薄膜過濾法（B），即以含0.1%聚山梨酯80的0.1%蛋白胨水溶液為沖洗液（沖洗量為每膜200ml）進(jìn)行測定，霉菌、酵母菌數(shù)采用培養(yǎng)基稀釋法（每皿0.2ml）測定，對控制菌金黃色葡萄球菌采用培養(yǎng)基稀釋法（培養(yǎng)基300ml），銅綠假單胞菌采用常規(guī)法。對3批樣品進(jìn)行檢驗，結(jié)果可確定上述方法為本品的微生物限度檢查方法，詳見表5。

表5 3批樣品微生物限度檢查方法驗證試驗結(jié)果Tab 5 Results of validation tests of microbial limit test for 3batches of samples

3 討論

（1）增溶劑對試驗結(jié)果的影響：復(fù)方硫磺洗劑處方中主要抑菌成分為升華硫，不溶于水，微溶于乙醇、醚，易溶于二硫化碳。最直接、有效的去除抑菌活性的方法當(dāng)屬薄膜過濾法。試驗中，薄膜過濾采用以0.1%蛋白胨水溶液為沖洗液從100ml至800ml進(jìn)行沖洗，但枯草芽孢桿菌的回收率仍無法達(dá)到《中國藥典》70.0%的要求；且試驗菌生長緩慢、弱小，往往需要延長2d培養(yǎng)時間。聚山梨酯80是非離子型的表面活性劑，具有乳化、擴散、增溶和穩(wěn)定的作用，還可作為中和劑（滅活劑），即其使用不但增加藥品的溶解性，還對藥品抑菌性具有中和作用[2]，故選擇聚山梨酯80作為增溶劑。其增溶機制是表面活性劑在水中形成“膠束”的結(jié)果，由于膠束的內(nèi)部與周圍溶劑的介電常數(shù)不同，難溶性藥物根據(jù)自身的化學(xué)性質(zhì)，以不同方式與膠束相互作用，使藥物分子分散在膠束中。對增溶劑的加入量進(jìn)行選擇，結(jié)果顯示，加入量過小，不能完全分散藥物；加入量過大，會出現(xiàn)過量的泡沫，影響沖洗效果。故最后以0.1%的聚山梨酯80作為增溶劑，可滿足試驗需要。

（2）不同醫(yī)院生產(chǎn)的復(fù)方硫磺洗劑在微生物限度檢查方法有所不同，有使用薄膜過濾法[3]，也有采用離心沉淀法結(jié)合薄膜過濾法[4]。原因有可能是不同醫(yī)院同一制劑在處方原料和制備方法上有所不同，由于制劑穩(wěn)定性的問題，有的醫(yī)院可能對該制劑作一些改進(jìn)；也可能有的醫(yī)院用升華硫，有的用沉降硫；還有可能硫磺的質(zhì)量不同等。因此，在藥品監(jiān)督檢驗工作中，經(jīng)常遇到同一制劑不同生產(chǎn)廠家提供的微生物限度檢查資料所采用的方法不同的情況，比如有常規(guī)法、培養(yǎng)基稀釋法、離心沉淀法、薄膜過濾法等。

微生物限度檢查目前在國外越來越受到重視，每版藥典收載的品種也越來越多，如《美國藥典》（USP）24版收載微生物限度品種（217個）較23版（150個）增加67個[5]。從發(fā)展趨勢來看，國家藥品標(biāo)準(zhǔn)對不同單位生產(chǎn)的同一劑型同一品種的藥品應(yīng)制訂統(tǒng)一的檢驗方法，以促進(jìn)我國由以劑型制訂微生物限度標(biāo)準(zhǔn)向以品種制訂微生物限度標(biāo)準(zhǔn)過渡工作的進(jìn)行。從本試驗結(jié)果得出，為了制訂科學(xué)合理的復(fù)方硫磺洗劑微生物限度檢查方法，建議統(tǒng)一采用在沖洗液中加入0.1%聚山梨酯80的薄膜過濾法較為穩(wěn)妥。該方法具有簡便、實用的特點。

（3）《中國藥典》規(guī)定[1]，若藥品的組分或原檢驗條件發(fā)生改變可能影響檢驗結(jié)果時，對檢查方法應(yīng)重新驗證。由于進(jìn)行再驗證時，藥品中的活性成分未發(fā)生改變，故其抗菌譜也未改變，因此筆者認(rèn)為再驗證工作僅需針對《中國藥典》規(guī)定的全部驗證菌株中的最敏感菌株即可，而不必對全部菌株進(jìn)行再驗證。即對復(fù)方硫磺洗劑進(jìn)行再驗證時，僅需證明試驗中最敏感菌株（枯草芽孢桿菌）的回收率大于70.0%，即可說明檢查方法有效，無需再逐一驗證大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌和黑曲霉的回收率。采用這種方法，既可保證檢驗方法的有效性，又節(jié)省了大量人力、物力，使得驗證工作有可能成為日常檢驗的一部分。建議《中國藥典》逐步收載各抗菌藥物的最敏感驗證菌株作為質(zhì)控菌株，以方便日常檢驗工作。

[1] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：二部[S].2010年版.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：附錄107-116.

[2] 張光華，余立.聚山梨酯80和卵磷脂在化學(xué)藥微生物限度檢查時的中和作用[J].藥物分析雜志，2008，28（7）：1127.

[3] 夏巧鳳，王曉梅.復(fù)方硫磺洗劑微生物限度檢查方法研究[J].臨床合理用藥，2012，5（2B）：32.

[4] 馬曉璇，李汶，溫玉瑩.2種含硫磺制劑的微生物限度檢查方法驗證[J].今日藥學(xué)，2009，19（2）：50.

[5] 周劍，李霞.藥品微生物限度檢查法中幾種樣品前處理方法的可行性研究[J].中國藥房，2012，23（33）：3136.