采用改進的溶血試驗法考察低滲靜脈注射液的安全性

山廣志，任連杰，李群，張彤，陳思，余立#（1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所，北京100050；.北京市藥品檢驗所，北京 100035）

靜脈輸液的安全性問題歷來都為藥品研發(fā)、生產(chǎn)、使用與監(jiān)管部門所密切關(guān)注，而靜脈輸液的滲透壓及其導(dǎo)致的溶血情況與產(chǎn)品安全性密切相關(guān)。近年來，國內(nèi)藥學(xué)工作者利用冰點降低法對臨床使用的多種注射劑品種進行了滲透壓摩爾濃度考察[1-3]，有力地促進了國內(nèi)注射劑的質(zhì)量提升。

由于冰點降低法測得的數(shù)據(jù)主要反映注射劑中晶體物質(zhì)產(chǎn)生的滲透壓，因此，單一地采用冰點降低法對低滲注射液進行考察，往往忽略了藥物對血細胞的保護作用以及膠體溶液產(chǎn)生的膠體滲透壓等作用。為了掌握低滲注射液對血液細胞的真實影響程度，有必要進一步聯(lián)用溶血試驗對靜脈注射液進行安全性考察。

本文以2010年版《中國藥典》一部（中藥）[4]和二部（化學(xué)藥）[5]附錄中收載的“溶血與凝聚檢查法”為基礎(chǔ)進行了方法改進，采用供試品溶液直接進行試驗，消除了稀釋溶劑（生理鹽水，即0.9%氯化鈉溶液）對樣本滲透壓的影響；采用分光光度計進行檢測，提高了方法的客觀性和準(zhǔn)確性。通對對國內(nèi)外5個企業(yè)共3種規(guī)格8個批號的人血白蛋白樣品的體外溶血情況進行了考察，結(jié)果表明建立的方法能夠客觀反映注射液滲透壓對血細胞的影響，可為該類藥品的開發(fā)研究、藥品標(biāo)準(zhǔn)的科學(xué)制訂以及臨床醫(yī)師制訂給藥方案提供一定的參考。

1 材料

1.1 儀器

UV-2401PC紫外-可見分光光度計（日本島津公司）；SMC30B滲透壓摩爾濃度測定儀（天和醫(yī)療儀器有限公司）；純水機（美國Poll公司）；微量移液器（北京吉爾森科技有限公司）。

1.2 試劑

校正用標(biāo)準(zhǔn)氯化鈉溶液（以下簡稱校正溶液，天津天河醫(yī)療儀器有限公司，批號：080703、080704，滲透壓摩爾濃度：100、500mOsmol/kg）；0.9%氯化鈉溶液（自制，稱取氯化鈉4.5g加水溶解并稀釋至500ml，滲透壓摩爾濃度：289mOsmol/kg）。

1.3 樣品

市售品人血白蛋白[國內(nèi)A企業(yè)，批號：200810082、200811088，規(guī)格：10%（5g∶50ml）；國內(nèi) B 企業(yè)，批號：20081227、20081228，規(guī)格：20%（10g∶50ml）；國內(nèi)C企業(yè)，批號：20090102，規(guī)格：20%（10g∶50ml）；國外D企業(yè)，批號：TBAB7BJ001，規(guī)格：20%（10g∶50ml）；國內(nèi)E企業(yè)，批號：20081126、20081128，規(guī)格：20%（5g∶25ml）]；氯化鈉為優(yōu)級純。

新鮮兔血，來自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司的日本大耳白家兔，♂，18周齡，體質(zhì)量2.3kg，合格證號：SCXK（京）2010-0002。

2 方法與結(jié)果

2.1 滲透壓摩爾濃度的測定

以超純水調(diào)節(jié)儀器零點，分別用100、500mOsmol/kg校正溶液進行儀器校正。

取50μl供試品置于干燥潔凈測試管中，按照2010年版《中國藥典》三部（生物制品）附錄收載的滲透壓摩爾濃度測定法項下要求進行測定[6]。不同生產(chǎn)廠家的人血白蛋白注射液的滲透壓摩爾濃度見表1，表明除國外D企業(yè)生產(chǎn)的產(chǎn)品外其余產(chǎn)品均為低滲注射液。

表1 8批樣品滲透壓摩爾濃度及溶血率測定結(jié)果Tab 1 Results of osmolarity and hemolytic rate of 8batches of samples

2.2 低滲注射液溶血試驗

2.2.1 兔血紅細胞懸液的制備。取新鮮兔血約20ml，置于錐形瓶中，加入兩粒玻璃珠，室溫下置于搖床中振搖15min。加入0.9%氯化鈉溶液約50ml，振搖，棄去纖維蛋白，以3000r/min的速率離心5min，棄去上清液，用0.9%氯化鈉溶液洗滌沉渣，繼續(xù)以3000r/min的速率離心5min，直至上清液無色透明。小心移去上清液，用移液管取下層紅細胞5ml，加0.9%氯化鈉溶液至50ml，翻轉(zhuǎn)混勻。按表2中的陽性對照管方法制備并測定兔血紅細胞懸液在576nm波長處的吸光度（A），調(diào)整紅細胞懸液濃度，使A576nm在0.8～1.4之間。

2.2.2 溶血率的測定方法。由于試驗采用可見光波長檢測，考慮到各注射液顏色之間的差異，試驗除了制備陰性對照管、陽性對照管和供試品試驗管以外，還設(shè)置了供試品本底對照管，以消除注射液顏色對測定結(jié)果的影響。

按照表2分別加入相應(yīng)溶液制備成各試驗管，混勻。

表2 各試驗管的制備Tab 2 Preparation of each test tube

將各管置于（37±0.5）℃水浴30min；取出后冰浴10min，分別測定576nm波長處的吸光度。溶血率按照下式進行計算：溶血率＝（A供試品試驗管－A供試品本底對照管－A陰性對照管）/（A陽性對照管－A陰性對照管）×100%。

2.3 精密度試驗

精密量取0.9%氯化鈉溶液15ml，置于50ml量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，以得到的0.27%的氯化鈉溶液（滲透壓摩爾濃度為85mOsmol/kg）作為供試品溶液，照“2.2.2”項下方法，平行測定6份。結(jié)果溶血率分別為93.33%、93.52%、94.54%、94.09%、92.13%、91.33%，平均值為93.16%，RSD＝1.30%（n＝6），表明方法精密度良好。

2.4 重復(fù)性試驗

分別取批號為200810082的人血白蛋白注射液6份，照“2.2.2”項下方法測定，結(jié)果溶血率分別為48.96%、50.23%、48.57%、48.06%、49.36%、47.66%，平均值為48.80%，RSD＝1.88%（n＝6），表明方法重復(fù)性良好。

2.5 低滲注射液溶血率考察結(jié)果

取不同生產(chǎn)廠家的人血白蛋白樣品按照“2.2.2”項下方法進行測定，結(jié)果見表1。

表1結(jié)果顯示，滲透壓摩爾濃度低于200mOsmol/kg的低滲人血白蛋白制品均存在不同程度的溶血。當(dāng)人血白蛋白滲透壓摩爾濃度在191mOsmol/kg時，溶血率約為12%；當(dāng)滲透壓摩爾濃度降至154mOsmol/kg時，溶血率迅速升至約30%。

各廠家不同規(guī)格的人血白蛋白滲透壓摩爾濃度與溶血率之間的相關(guān)性并不完全一致，且不具有白蛋白劑量相關(guān)性。如：E廠家2批產(chǎn)品（20%規(guī)格）的滲透壓摩爾濃度約為110mOsmol/kg，溶血率約為60%；A廠家2批產(chǎn)品（10%規(guī)格）的滲透壓摩爾濃度約為70mOsmol/kg，而溶血率約為50%。說明不同廠家采用不同生產(chǎn)工藝和處方對溶血率亦有不同影響，同時說明單一利用冰點降低法考察摩爾滲透壓濃度并不能完全反映注射液由于低滲導(dǎo)致的溶血狀況。

3 討論

《中國藥典》（二部）（化學(xué)藥）自2000年版開始就收載了冰點降低法進行滲透壓摩爾濃度的測定，并要求靜脈輸液應(yīng)盡可能與血液等滲，且應(yīng)在標(biāo)簽上注明溶液的滲透壓摩爾濃度[7]。2010年版的《中國藥典》（一部）（中藥）和三部（生物制品）也增訂了滲透壓摩爾濃度測定法。但冰點降低法測定的摩爾滲透壓濃度主要反映稀溶液的晶體滲透壓[8]，對復(fù)雜組分注射液尤其是具有膠體性質(zhì)的注射液采用溶血法測定其溶血率，較單純采用冰點降低法進行滲透壓考察結(jié)果更加客觀。

2010年版《中國藥典》中收載的“溶血與凝聚檢查法”[4-5]主要適用于考察藥品本身所具有的溶血特性。試驗過程中采用0.9%氯化鈉溶液稀釋供試品溶液，不適用于由注射液低滲導(dǎo)致的溶血情況的考察；且結(jié)果判斷采用人工目視，對于有色供試品的結(jié)果判斷存在一定困難。本文對《中國藥典》方法進行了改進，采用供試品溶液直接進行試驗，消除了稀釋溶劑對樣本滲透壓的影響；并采用分光光度法對試驗結(jié)果進行檢測，提高了方法的客觀性和準(zhǔn)確性。

方法建立過程中采用陽性對照管溶液在200～800nm波長范圍內(nèi)進行光譜掃描，在可見光區(qū)的最大吸收波長為576nm；而供試品本底對照管溶液在可見光區(qū)無明顯吸收，且A576nm＜0.05，故本法選擇576nm作為檢測波長。

人血白蛋白屬于膠體溶液，可維持70%～80%血漿有效膠體滲透壓[9]。筆者曾采用冰點降低法對國內(nèi)外人血白蛋白產(chǎn)品的滲透壓進行考察，結(jié)果顯示當(dāng)時的國內(nèi)市場上國產(chǎn)人血白蛋白滲透壓摩爾濃度在100～200mOsmol/kg范圍內(nèi)，大多屬于低滲注射液[3]。2010年版《中國藥典》（三部）在人血白蛋白質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中首次增加了滲透壓摩爾濃度檢查項[6]。本試驗結(jié)果證實：《中國藥典》將人血白蛋白滲透壓摩爾濃度規(guī)定在210～400mOsmol/kg范圍內(nèi)，能夠有效防止低滲人血白蛋白對使用者造成的影響（本文采用的試驗樣品為2010年版《中國藥典》實施前收集的市售產(chǎn)品）。

利用溶血試驗進一步考察低滲注射液的臨床安全性是對僅憑冰點降低法檢查滲透壓、間接研究注射液對血紅細胞影響的有效補充，可以更直接準(zhǔn)確地反映制劑對血細胞的影響。建議研發(fā)靜脈輸液品種時除了采用冰點降低法進行滲透壓考察外，還應(yīng)進行溶血情況考察；臨床進行靜脈注射液配伍使用和給藥方式研究時，也建議關(guān)注輸注藥液的滲透壓摩爾濃度情況，并進行溶血試驗考察，防止由于輸注低滲注射液導(dǎo)致體液滲透壓改變而影響患者耐受性甚至導(dǎo)致安全性問題的出現(xiàn)。

[1] 李婭萍，楊敏智，張斗勝，等.2009年國產(chǎn)加替沙星注射劑評價性抽驗結(jié)果及質(zhì)量評價[J].藥物分析雜志，2011，31（3）：484.

[2] 王波，李斌，孫吉令.六種靜脈輸液品種滲透壓摩爾濃度考察結(jié)果分析[J].中國藥品標(biāo)準(zhǔn)，2010，11（5）：351.

[3] 山廣志，紀宏，余立，等.國內(nèi)外人血白蛋白產(chǎn)品的滲透壓現(xiàn)狀調(diào)研[J].中國新藥雜志，2009，18（16）：1490.

[4] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部[S].2010年版.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：附錄92-93.

[5] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：二部[S].2010年版.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：附錄116.

[6] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：三部[S].2010年版.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：212-213、附錄30-31.

[7] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：二部[S].2000年版.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2000：附錄71.

[8] 屠錫德，張均壽，朱家壁.藥劑學(xué)[M].3版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2002：586-588.

[9] 段紅杰，柴家科，鄧虎平.人血白蛋白的功能及其在危重病治療中的應(yīng)用[J].解放軍醫(yī)學(xué)雜志，2012，37（10）：926.