姜黃素對人鼻咽癌株CNE-2Z細胞凋亡的影響及機制研究

王桂秋

鼻咽癌(Nasopharyngeal carcinoma，NPC)是高 發(fā)惡性腫瘤之一，生長位置深，并有重要血管神經(jīng)相鄰，不易發(fā)現(xiàn)且不易手術(shù)切除［1-2］。臨床上多采用放射治療作為NPC首選治療方案，但因其具有中度敏感性、較高分化、預(yù)后差及易復(fù)發(fā)等特點，臨床上也多采用外科切除和藥物干預(yù)等方法進行治療［3］。姜黃素(Curcumin，CU)是一種從姜黃根莖(Curcuma L.)中提取的活性成分，具有廣泛的藥理作用，如抗氧化、抗發(fā)炎、降血脂［4］作用。其中，姜黃素抑制腫瘤的作用已由眾多實驗中得到證實，同時其抗癌機制已成為國內(nèi)外研究的熱點［5-8］。本試驗擬采用體外人鼻咽癌株 CNE-2Z細胞模型，探討CU對CNE-2Z中內(nèi)源性PI3K/Akt通路的影響，為闡明其對NPC的誘導(dǎo)凋亡作用機制提供科學(xué)的理論依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 細胞 人鼻咽癌母系細胞株CNE-2Z細胞購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤細胞庫。

1.2 藥物與試劑 姜黃素(純度＞96%):Sigma公司。DMEM培養(yǎng)基:Gibco公司。小牛血清:Hyclone公司。胰蛋白酶:Sigma公司。0.25%胰酶:Gibco公司。8-羥基-2-脫氧鳥苷(8-OHdG)ELISA試劑盒:武漢博士德公司。甲基偶氮唑鹽(MTT):Sigma公司。二甲基亞砜(DMSO):Sigma公司。熒光染料hoechest33342:Biotium公司。PI3K和Akt抗體:武漢博士德公司。蛋白裂解液:武漢博士德公司。磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)一抗、二抗:Sigma公司。

1.3 儀器 ZHJH-C1214C垂直流超凈工作臺(杭州匯爾儀器設(shè)備有限公司)。CO2培養(yǎng)箱(美國Thermo Fisher公司)。IX71-A21PH倒置顯微鏡(日本Olympus公司)。JC303A-T電熱恒溫培養(yǎng)箱(成都一恒科技有限公司)。GelDoc XR+凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio-rad公司)。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng) 將胰酶用D-Hank's液配成0.05%的濃度，并置于37℃水浴中孵化。用10 mL含20%血清的培養(yǎng)液重懸CNE-2Z細胞，接種于60 cm2的培養(yǎng)瓶中，放置在培養(yǎng)箱中2 h后，取出，將未貼壁的細胞懸液取出，臺盼藍拒染法計數(shù)后，加入培養(yǎng)液調(diào)整細胞濃度為5×105個/mL，接種到目的培養(yǎng)器皿中。接種后24 h，用溫的培養(yǎng)基輕輕沖洗培養(yǎng)的CNE-2Z細胞1次，除去未貼壁的細胞，再更換培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)孵化。

2.2 分組及給藥 孵化使細胞貼壁后，用含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基稀釋成不同濃度的CU終濃度(0、20、40、80 μmol/L)，每孔 100 μL，同時設(shè)3個平行孔/組。重復(fù)實驗5次，獲取平均值數(shù)據(jù)。應(yīng)用Graphpad Prism軟件計算IC50(半數(shù)抑制率)，即CU干預(yù) CNE-2Z細胞24、48 h后的 IC50值。同時增設(shè)對照組。

細胞增殖抑制率 =(OD對照-OD治療)/(OD對照-OD空白)×100%

2.3 指標檢測 MTT法檢測其對CNE-2Z抑制增殖的作用，ELISA法檢測8-羥基-2-脫氧鳥苷(8-OHdG)水平，Hoechst33342染色檢測細胞形態(tài)學(xué)的變化，Western blotting法檢測PI3K和Akt磷酸化水平。所有實驗步驟均嚴格按照供應(yīng)商說明書進行操作。

2.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 13.0軟件，數(shù)據(jù)以±s表示，組間比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 CU干預(yù)對CNE-2Z細胞抑制作用 MTT法數(shù)據(jù)表明，梯度濃度的CU對CNE-2Z細胞增殖的抑制作用逐漸增加，與空白對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。實驗結(jié)果同時提示，CU對CNE-2Z的干預(yù)有明顯的劑量和時間依賴關(guān)系。見表1。

表1 梯度濃度的CU對CNE-2Z細胞抑制作用(n=10)

3.2 CU干預(yù)對CNE-2Z細胞8-OHdG水平的影響

ELISA結(jié)果顯示，與空白對照組比較，CU干預(yù)組CNE-2Z細胞中8-OHdG表達逐漸增多，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。其中，高劑量CU組表現(xiàn)出明顯的促進8-OHdG表達的效果，體現(xiàn)出一定的劑量依賴關(guān)系。見圖1。

3.3 CU干預(yù)對CNE-2Z細胞凋亡形態(tài)變化的影響 Hoechst33342染色結(jié)果顯示，空白對照組中CNE-2Z的細胞核呈現(xiàn)為均勻彌散的淡藍色熒光，核飽滿，胞漿豐富。20 μg/mL濃度CU干預(yù)48 h后，開始有部分CNE-2Z細胞核出現(xiàn)碎裂，藍色熒光加強并出現(xiàn)細胞密度減少。40/80 μg/mL濃度CU干預(yù)后，CNE-2Z細胞分散，并造成核裂解和染色質(zhì)聚集，呈現(xiàn)致密較強藍色熒光，并伴隨著凋亡細胞計數(shù)的增多。見圖2。

圖1 CU干預(yù)對CNE-2Z細胞內(nèi)源性8-OHdG表達的影響(±s，n=10)

圖2 CU干預(yù)對CNE-2Z細胞凋亡的影響(Hoechst33342染色，×200)

3.4 CU干預(yù)對CNE-2Z細胞p-PI3K和p-Akt表達的影響 Western blotting分析表明，空白對照組中p-PI3K和p-Akt磷酸化程度較高，處于過激活狀態(tài)。經(jīng)CU干預(yù)48 h后，CNE-2Z細胞中p-PI3K和p-Akt表達水平顯著下調(diào)，表現(xiàn)出一定的劑量和時間依賴性，與空白對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。見圖3。

圖3 CU干預(yù)對CNE-2Z細胞內(nèi)源性8-OHdG磷酸化水平的影響(±s，n=10)

4 討論

鼻咽癌是我國南方各省份地區(qū)常見的惡性腫瘤，在醫(yī)學(xué)技術(shù)迅猛發(fā)展的今天，其發(fā)病率卻一直居高不下。而且鼻咽癌易擴散、轉(zhuǎn)移，具有較高的隱蔽性，使得病情診斷存在一定的困難［9-10］。放射治療一直是鼻咽癌的基本治療方法。因鼻咽癌常有局部組織浸潤或顱底骨質(zhì)破壞，手術(shù)常不能徹底清除病灶。早中期鼻咽癌的5年生存率平均在80%左右，而晚期僅為20% ～30%。因此，開發(fā)有效的治療手段可以最大程度地降低患者的痛苦和社會的負擔(dān)，而中藥活性成分的發(fā)掘就成為抗癌治療的潛在策略［11］。在本研究中，MTT實驗結(jié)果顯示，CNE-2Z細胞未受藥物干預(yù)時不受控制的增殖趨勢，提示抑制癌細胞的增殖可以有助于控制癌癥病情。CU干預(yù)有效地抑制了CNE-2Z的增殖，初步說明CU具有抑制CNE-2Z細胞增殖作用。細胞DNA發(fā)生損傷時，脫氧鳥苷C-8位點受氧化應(yīng)激作用8-羥基-脫氧鳥苷(8-OHdG)，造成體循環(huán)中8-OHdG濃度異常升高［12］。故檢測細胞群中的8-OHdG代謝水平，可以間接反映癌細胞增殖狀況。本實驗中CU顯著增加8-OHdG的表達水平，提示CU抗細胞增殖作用與誘導(dǎo)CNE-2Z細胞發(fā)生氧化破壞 DNA雙鏈有關(guān)。同時，Hoechst33342染色觀察到，CU干預(yù)的CNE-2Z細胞明顯發(fā)生了細胞核病變，進一步說明了CU誘導(dǎo)CNE-2Z細胞凋亡而發(fā)揮抗腫瘤作用。

有研究結(jié)果表明，PI3K/Akt通路活性介導(dǎo)下游靶基因/蛋白的表達，進而啟動一系列復(fù)雜的細胞級聯(lián)反應(yīng)，調(diào)控著細胞的增殖、分化、生長和凋亡的病理生理過程［13-15］。此外，PI3K/Akt通路的激活與癌癥發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［16-17］，研究發(fā)現(xiàn)，癌細胞通過增強PI3K與Akt的磷酸化活性，調(diào)控細胞周期蛋白的表達，下調(diào)腫瘤壞死因子(TNF)的基因轉(zhuǎn)錄，促進細胞不斷地增殖和生長［18-19］。因此，抑制癌細胞中的PI3K和Ak磷酸化水平是治療癌癥的積極策略［20-21］。本研究中，Western blotting結(jié)果表明，CNE-2Z細胞中 p-PI3K、p-Akt表達明顯增多，處于激活狀態(tài)。經(jīng)CU干預(yù)后，CNE-2Z細胞中高表達的PI3K和Akt磷酸化水平被有效抑制，提示抑制內(nèi)源性PI3K/Akt通路是CU抗腫瘤的作用機制之一。

綜上所述，姜黃素具有抑制CNE-2Z細胞增殖的作用，將為其今后在臨床中的應(yīng)用提供有效的基礎(chǔ)理論依據(jù)。但姜黃素是否能有效合理地應(yīng)用于鼻咽癌患者的臨床治療還需要進一步的研究。

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