人睪丸組織TRIM69蛋白具有催化多聚泛素鏈形成的活性

韓永卿，李 容，高晉蘭，繆時英，王琳芳

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)國家重點實驗室，北京100005)

精子發(fā)生的每一個發(fā)育階段，都伴有差異基因精確而有序地表達(dá)［1］。因此，深入了解與精子發(fā)生密切相關(guān)的差異表達(dá)基因，將有助于揭示生殖及進(jìn)化的奧秘。

研究表明，泛素化修飾在精子發(fā)生過程中發(fā)揮重要的作用，該修飾過程是通過多種酶級聯(lián)反應(yīng)實現(xiàn)的［2］，其中E3泛素連接酶具有特異性識別底物的功能，目前精子發(fā)生過程中已有很多個差異表達(dá)基因被鑒定為E3泛素連接酶，其在精子發(fā)生過程中的作用機(jī)制正逐漸成為研究熱點［3］。

從人睪丸消減cDNA文庫中擴(kuò)增到一個差異表達(dá)基因，命名為HSD-34，經(jīng)序列比對為人源TRIM69基因編碼區(qū)，該基因編碼的蛋白屬于TRIM家族蛋白，文獻(xiàn)提示TRIM家族很多成員都具有E3泛素連接酶活性［4－6］。該家族蛋白結(jié)構(gòu)特點是含有保守的RING finger結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域在介導(dǎo)泛素化修飾過程中發(fā)揮重要作用，因此推測，TRIM69也具有E3泛素連接酶活性，能夠促進(jìn)多聚泛素鏈形成。本研究旨在鑒定TRIM69是否具有催化多聚泛素鏈形成的活性，為進(jìn)一步驗證其是一個新的E3泛素連接酶奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒和重組體構(gòu)建

通過PCR技術(shù)，分別把TRIM69WT(1～1 503 bp)、TRIM69CA(1 ～1 503 bp，C61/64A)、TRIM69ΔR(247～1 503 bp)構(gòu)建到 pcDNA6/V5-HisB載體上;把TRIM69WT(1～1 503 bp)構(gòu)建到pGEX-4T-3載體上以及把HA-Ub構(gòu)建到pMSCVpuro載體上。

1.2 抗體來源

anti-Flag和anti-HA抗體(Sigma-Aldrich公司)，anti-GST抗體(MBL公司)，anti-ubiquitin(P4D1)抗體(Santa Cruz公司)。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)和細(xì)胞轉(zhuǎn)染

HEK 293T和HeLa細(xì)胞(ATCC公司)，培養(yǎng)基為加有10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基，細(xì)胞在含5%CO2，37℃的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。HEK293T細(xì)胞用engreen-D轉(zhuǎn)染試劑(英格恩公司)轉(zhuǎn)染，HeLa細(xì)胞用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑(英俊公司)轉(zhuǎn)染。

1.4 穩(wěn)定細(xì)胞篩選

首先確定HeLa細(xì)胞的嘌呤霉素最小致死濃度，經(jīng)篩選確定為5 mg/L;將構(gòu)建好的真核表達(dá)質(zhì)粒pMSCVpuro-HA-Ub，轉(zhuǎn)染進(jìn)HeLa細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48 h后加入最小致死濃度的嘌呤霉素，每天換液1次，經(jīng)過2周左右的篩選，存活的細(xì)胞為穩(wěn)定表達(dá)HA-Ub基因的細(xì)胞。

1.5 誘導(dǎo)表達(dá)純化

將pGEX-4T-3和pGEX-4T-3-TRIM69重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，裂解細(xì)胞，收集上清，過Glutathione SepharoseTM4B親和層析柱上，洗脫、分管收集、鑒定，將含目標(biāo)蛋白質(zhì)的組分合并、濃縮、上樣于Superdex200柱上純化2次，用于后續(xù)泛素化實驗。

1.6 免疫沉淀

轉(zhuǎn)染后48 h收集細(xì)胞，用如下裂解液裂解細(xì)胞，［50 mmol/L Tris-HCl(pH 7.5)，150 mmol/L NaCl，0.5%NP40，1%SDS］，100 ℃ 煮沸10 min，15.7 ×1 000 g室溫離心15 min，上清1 mg用稀釋緩沖液稀釋10倍［50 mmol/L Tris-HCl(pH 7.5)，150 mmol/L NaCl，0.5%NP40］，然后加入 Flag-M2-agarose(Sigma-Aldrich公司)室溫孵育1 h，免疫沉淀物用洗脫緩沖液(50 mmol/L Tris-HCl(pH 7.5)，150 mmol/L NaCl，0.5%NP40，0.1%SDS)洗 5 次，8%SDSPAGE跑膠，用相應(yīng)抗體檢測。

2 結(jié)果

2.1 TRIM69蛋白結(jié)構(gòu)域分析以及RING結(jié)構(gòu)域氨基酸序列比對

TRIM69編碼的蛋白結(jié)構(gòu)域分析(圖1A):N-末端41～82位氨基酸殘基構(gòu)成RING結(jié)構(gòu)域，110～144位氨基酸殘基構(gòu)成B-box結(jié)構(gòu)域，175～195位和226～253位氨基酸殘基構(gòu)成coiled-coil結(jié)構(gòu)域，C-末端305～500位氨基酸殘基構(gòu)成 B30.2結(jié)構(gòu)域，即具有RING-B-box-coiled-coil(RBCC)3個連續(xù)的結(jié)構(gòu)域，因此，該蛋白質(zhì)屬于TRIM/RBCC蛋白質(zhì)家族成員。TRIM69屬于C-IV亞家族，與該亞家族的其他幾個成員相比含有相同的C3HC4 RING結(jié)構(gòu)域(圖1B)。

2.2 GST和GST-TRIM69的誘導(dǎo)表達(dá)

考馬斯亮藍(lán)結(jié)果(圖2)顯示目標(biāo)分子質(zhì)量位置(GST:26 ku和GST-TRIM69:82 ku)有高表達(dá)的蛋白條帶，在該種誘導(dǎo)條件下，GST蛋白在上清中有較多表達(dá)，而GST-TRIM69融和蛋白在上清中有少量表達(dá)。

圖1 TRIM69結(jié)構(gòu)域模式圖Fig 1 The domain structure of TRIM69

圖2 GST-TRIM69以及GST在大腸桿菌BL21(DE3)細(xì)胞中的誘導(dǎo)表達(dá)Fig 2 The expression of GST or GST-TRIM69 fusion protein induced in Escherichia coli BL21(DE3)

2.3 GST和GST-TRIM69蛋白的純化

層析純化的產(chǎn)物經(jīng)過考馬斯亮藍(lán)和Western blot鑒定(圖3，4)，目的蛋白質(zhì)純度達(dá)到95%以上，可以用于后續(xù)的泛素化實驗。

2.4 細(xì)胞外泛素化實驗分析TRIM69能夠催化多聚泛素修飾的產(chǎn)物形成

純化的GST蛋白和GST-TRIM69融合蛋白偶連GSH-Sepharose4B珠子上，在有或無293T細(xì)胞提取物存在條件下，30℃孵育1 h，用泛素抗體檢測泛素化條帶。

在293T細(xì)胞提取物存在條件下，加入GSTTRIM69融合蛋白的實驗組能夠檢測到泛素化條帶，而加入GST蛋白的對照組則檢測不到泛素化條帶，說明TRIM69具有催化多聚泛素鏈形成活性;另外在沒有293T提取物存在條件下，即使加入GSTTRIM69也未見泛素化條帶，說明293T細(xì)胞提取物含有泛素化反應(yīng)所需的其他物質(zhì)，如E1、E2等(圖5)。

圖5 細(xì)胞外泛素化試驗分析TRIM69能夠催化多聚泛素修飾的產(chǎn)物形成Fig 5 The activity of TRIM69 in catalyzing the formation of muti-uiquitination assayed by‘in vitro ubiquitination’experiment

2.5 細(xì)胞內(nèi)泛素化實驗分析TRIM69能夠催化多聚泛素修飾的產(chǎn)物形成

將Flag-TRIM69和pcDNA6-Flag空載質(zhì)粒分別與HA-Ub質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染40 h后收集細(xì)胞，經(jīng)免疫沉淀和Western blot檢測，結(jié)果顯示:(anti-HA抗體和anti-Flag)兩種抗體檢測的結(jié)果相同，與對照組相比，實驗組可見明顯呈階梯狀的條帶，說明TRIM69具有催化多聚泛素鏈形成的活性(圖6A)。

帶Flag標(biāo)簽空載、帶Flag標(biāo)簽的TRIM69WT、TRIM69CA、TRIM69ΔR質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染進(jìn) HA-Ub穩(wěn)定表達(dá)的HeLa細(xì)胞株，經(jīng)免疫沉淀和Western blot檢測，結(jié)果顯示，與空載對照組相比，TRIM69WT組可見明顯高分子量彌散條帶，而當(dāng)RING結(jié)構(gòu)域點突變 (CA)或缺失 (ΔR)，催化形成的高分子量彌散條帶明顯減弱，提示TRIM69具有催化多聚泛素鏈形成的活性且該活性與RING結(jié)構(gòu)域有關(guān)(圖6B)。

3 討論

TRIM69小鼠同源物基因特異地表達(dá)于小鼠睪丸圓形精子細(xì)胞中［7］。有關(guān)它的功能，僅有1篇文獻(xiàn)報道［8］。有關(guān)人源 TRIM69基因功能方面的文章，還沒有文獻(xiàn)報道。本研究通過細(xì)胞內(nèi)外泛素化實驗觀察到TRIM69能夠催化多聚泛素化產(chǎn)物形成，而且該反應(yīng)過程依賴于 RING結(jié)構(gòu)域，提示TRIM69具有E3泛素連接酶活性。

E3泛素連接酶在精子發(fā)生過程中發(fā)揮重要作用，如RNF8在圓形精子細(xì)胞向長形精子細(xì)胞發(fā)育過程中發(fā)揮作用［9－10］;RNF151在頂體形成過程中發(fā)揮作用［11］;ZNF645在精子質(zhì)量控制方面發(fā)揮作用［12］。

在人、小鼠及大鼠精子發(fā)生過程中，有很多含有RING結(jié)構(gòu)域的蛋白參與其中，但其中只有少數(shù)蛋白被鑒定具有E3泛素連接酶活性。所以鑒定了TRIM69蛋白具有催化多聚泛素化的活性，為進(jìn)一步闡明其是一個新的E3泛素連接酶以及其在精子發(fā)生過程中的作用提供了依據(jù)。

圖6 細(xì)胞內(nèi)泛素化試驗分析TRIM69能夠催化多聚泛素修飾的產(chǎn)物形成Fig 6 The activity of TRIM69 in catalyzing the formation of muti-uiquitination assayed by in vivo ubiquitination

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