油酸調(diào)節(jié)人血管平滑肌細(xì)胞TLR4的增殖活性及炎性因子的表達(dá)

楊海靜，陳 衛(wèi)，權(quán)金星，李偉華，劉 靜，邱明才

(1.蘭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)研究所;2.甘肅省人民醫(yī)院內(nèi)分泌科;3.甘肅省人民醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，甘肅蘭州730000;4.天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院內(nèi)分泌科，天津300052)

大血管病變是2型糖尿病常見(jiàn)的慢性并發(fā)癥，動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂和血管平滑肌細(xì)胞增生是動(dòng)脈粥樣硬化形成和發(fā)展的重要病理機(jī)制。

TLR4是介導(dǎo)固有免疫和炎性反應(yīng)的關(guān)鍵因子，有研究發(fā)現(xiàn)，低濃度的TLR4天然配體脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)可激活人冠狀動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞 TLR4 信號(hào)及其下游炎性因子的表達(dá)［1－2］，提示人主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞(human aortic vascular smooth muscle cells，HA-VSMC)TLR4信號(hào)的激活可誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生炎性反應(yīng)，可能在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中起重要作用。游離脂肪酸(free fatty acid，F(xiàn)FA)是2型糖尿病胰島素抵抗和動(dòng)脈粥樣硬化形成和發(fā)展的重要致病因素，F(xiàn)FA通過(guò)多種途徑誘導(dǎo)動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂和血管平滑肌細(xì)胞增生，促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展。有研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)FA可激活人血管內(nèi)皮細(xì)胞TLR4信號(hào)導(dǎo)致人血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生炎性反應(yīng)［3］，但FFA能否誘導(dǎo)人血管平滑肌細(xì)胞產(chǎn)生炎性反應(yīng)尚未見(jiàn)報(bào)道。

本研究通過(guò)研究油酸對(duì)HA-VSMC TLR4基因及其下游炎性因子表達(dá)的調(diào)節(jié)作用，以期進(jìn)一步闡明2型糖尿病大血管并發(fā)癥的發(fā)病機(jī)制，亦為今后將TLR4作為2型糖尿病抗炎治療的靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清和二甲基亞砜(Gibco公司)，油酸和LPS(Sigma公司)，Trizol RNA提取試劑盒(Invitrogen公司)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒(大連寶生物公司)，SYBR? Green Master Mix(日本東洋紡株式會(huì)社)，蛋白抽提試劑盒(普利萊基因技術(shù)有限公司)，鼠抗人TLR4和兔抗人β-肌動(dòng)蛋白多克隆抗體(CST公司)，IL-6、IL-8和 MCP-1 ELISA試劑盒(R＆D公司)，HA-VSMC細(xì)胞系(ATCC公司)，引物由上海生工生物工程公司合成。

1.2 方法

1.2.1 HA-VSMC培養(yǎng)和藥物干預(yù)實(shí)驗(yàn):將HA-VSMC細(xì)胞復(fù)蘇后，于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)至80% ～90%匯合時(shí)，用0.25%的胰蛋白酶消化傳代。以1×105個(gè)/mL的濃度接種細(xì)胞，待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，換用含0.25%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h后進(jìn)行干預(yù)試驗(yàn)。不同濃度的油酸(50、100 和200 μmol/L)處理 HA-VSMC，未加藥物組為對(duì)照組，LPS組作為陽(yáng)性對(duì)照。在相應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)收獲細(xì)胞提取總RNA和細(xì)胞蛋白，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清用以檢測(cè)TLR4、IL-6、IL-8及MCP-1mRNA和蛋白的表達(dá)水平。

1.2.2 四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性:收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞，培養(yǎng)至細(xì)胞單層鋪滿孔底后，更換含0.25%胎牛血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，加入油酸(濃度分別為 50、100、200 和300 μmol/L)繼續(xù)培養(yǎng)24 h，然后每孔加入20 μL MTT溶液，孵育4 h后終止培養(yǎng)，吸棄培養(yǎng)液。每孔加入150 μL二甲基亞砜，低速振蕩10 min，然后測(cè)量吸光度值。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)TLR4、IL-6、IL-8和MCP-1 mRNA表達(dá):1)RNA提取和反轉(zhuǎn)錄:用Trizol提取HA-VSMC總RNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)定其濃度和純度，1%甲醛變性膠電泳鑒定總RNA完整性。每份標(biāo)本取2 μg RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA轉(zhuǎn)錄合成為 cDNA，將 cDNA產(chǎn)物貯存于－20℃?zhèn)溆?，?shí)驗(yàn)方法按試劑盒說(shuō)明書操作。2)引物:TLR4:上游 5'-TGAGCAGTCGTGCTGGTATC-3'，下游5'-CAGGGCTTTTCTGAGTCGTC-3';IL-6:上游5'-TACCCCCAGGAGAAGATTCC-3'，下游 5'-TTTTCT GCCAGTGCCTCTTT-3';IL-8:上游 5'-GTGCAGTTTT GCCAAGGAGT-3'，下游 5'-CTCTGCACCCAGTTTTCC TT-3';MCP-1:上游5'-AACACTCACTCCACAACCCA AG-3'，下 游:5'-TGTGGTTCAAGAGGAAAAGCAAT-3';β-actin:上游 5'-GCACCACACCTTCTACAATGA G-3'，下 游 5'-ATAGCACAGCCTGGATAGCAAC-3'。擴(kuò)增片段長(zhǎng)度分別為 167、175、196、230 和164 bp。3)反應(yīng)體系:25 μL實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增體系包括上下游引物(10 μmol)各1μL，cDNA 5 μL，定量PCR反應(yīng)混合物(SYBR? Green Master Mix)12.5 μL，ddH2O 5.5 μL。4)PCR 循環(huán)參數(shù):擴(kuò)增條件為95℃ 預(yù)變性5 min，95℃ 10 s，58℃ 20 s，72℃ 30 s，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)。采用β-actin做為內(nèi)參照和2－△△Ct相對(duì)定量法［4］來(lái)評(píng)價(jià)目的基因 mRNA的表達(dá)水平。

1.2.4 Western印跡法檢測(cè)TLR4蛋白表達(dá)水平:采用不同劑量的油酸或 LPS(10 μg/L)處理細(xì)胞24 h后，提取細(xì)胞總蛋白，牛碳酸酐酶(BCA)法測(cè)定蛋白濃度，經(jīng)SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜封閉后，分別加入一抗、二抗孵育，電化學(xué)發(fā)光法(ECL)顯色，X線膠片曝光。以TLR4蛋白與β-肌動(dòng)蛋白的吸光度比值表示TLR4蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

1.2.5 ELISA法檢測(cè)IL-6、IL-8、MCP-1蛋白表達(dá):收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，采用ELISA試劑盒檢測(cè)IL-6、IL-8、MCP-1蛋白含量，實(shí)驗(yàn)操作參照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 油酸對(duì)HA-VSMC細(xì)胞增殖活性的影響

不同濃度的油酸處理HA-VSMC 24 h后吸光度值分 別 為 50μmol/L(0.45 ± 0.00)、100 μmol/L(0.79 ± 0.04)、200 μmol/L(1.22 ± 0.01)、300 μmol/L(1.03±0.01)，與對(duì)照組(0.35 ±0.03)比較P＜0.05。

2.2 油酸調(diào)節(jié) HA-VSMC細(xì)胞 TLR4、IL-6、IL-8和MCP-1 mRNA表達(dá)

油酸調(diào)節(jié)HA-VSMC中TLR4和炎性因子IL-6、IL-8和MCP-1 mRNA的表達(dá)具有明顯的時(shí)間-劑量依賴性。油酸上調(diào) TLR4、IL-6、IL-8和 MCP-1 mRNA表達(dá)最大上調(diào)幅度分別為對(duì)照組的6.5、7.4、7.4和7.1 倍(P ＜0.05)(表 1，2，3，4)。10 μg/L LPS處理細(xì)胞24 h時(shí)后 TLR4、IL-6、IL-8和 MCP-1 mRNA的表達(dá)分別為對(duì)照組的5.9、6.5、6.9和6.8倍(P＜0.05)(圖1)。

2.3 Western印跡法檢測(cè)TLR4蛋白表達(dá)水平結(jié)果

采用不同濃度的油酸(50、100和200 μmol/L)處理細(xì)胞24 h后，TLR4蛋白表達(dá)量呈增加趨勢(shì)，其灰度值比值分別為(0.67±0.19)、(1.15±0.56)和(1.70 ±0.62)，200 μmol/L組與對(duì)照組(0.29 ±0.22)比較P＜0.05。LPS明顯促進(jìn)TLR4蛋白表達(dá)(1.93±0.87)，與對(duì)照組比較P＜0.01(圖2)。

表1 油酸對(duì)HA-VSMC TLR4 mRNA表達(dá)水平的影響Table 1 Effects of oleic acid on TLR4 mRNA expression in HA-VSMC

表2 油酸對(duì)HA-VSMC IL-6 mRNA表達(dá)的影響Table 2 Effects of oleic acid on IL-6 mRNA expression in HA-VSMC

表3 油酸對(duì)HA-VSMC IL-8 mRNA表達(dá)水平的影響Table 3 Effects of oleic acid on IL-8 mRNA expression in HA-VSMC

表4 油酸對(duì)HA-VSMC MCP-1 mRNA表達(dá)水平的影響Table 4 Effects of oleic acid on MCP-1 mRNA expression in HA-VSMC

圖1 LPS 干預(yù) HA-VSMC 24 h 后 TLR4、IL-6、IL-8和MCP-1 mRNA表達(dá)水平Fig 1 The levels of TLR4、IL-6、IL-8 and MCP-1 mRNA in HA-VSMC by LPS for 24 hours

圖2 油酸及LPS干預(yù)HA-VSMC細(xì)胞24 h后TLR4蛋白表達(dá)Fig 2 The expression of TLR4 protein in HA-VSMC by oleic acid and LPS for 24 hours(n=3)

2.4 油酸調(diào)節(jié)HA-VSMC細(xì)胞IL-6、IL-8、MCP-1蛋白含量

油酸促進(jìn)HA-VSMC中IL-6、IL-8和MCP-1蛋白表達(dá)。IL-6、IL-8和MCP-1蛋白表達(dá)的最大上調(diào)幅度為對(duì)照組的2.16、1.9倍和2.06倍(P＜0.05)。LPS處理細(xì)胞24 h時(shí)后可明顯促進(jìn)IL-6、IL-8和MCP-1蛋白水平的表達(dá)，分別為對(duì)照組的2.06、1.97和1.96倍(P ＜0.05)(表5，6，7)。

3 討論

血管內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂和平滑肌細(xì)胞增生是2型糖尿病動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生的重要病理機(jī)制。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，血管內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞的炎性反應(yīng)很可能參與了2型糖尿病動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展。

表5 各組HA-VSMC中IL-6蛋白含量Table 5 The expression of IL-6 proteins in various groups of HA-VSMC(，ng/L，n=3)

表5 各組HA-VSMC中IL-6蛋白含量Table 5 The expression of IL-6 proteins in various groups of HA-VSMC(，ng/L，n=3)

＊P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 compared with control group．

group 6 hours 12 hours 24 hours control 217±11 217±12 217±11 50 μmol/L 254 ±16* 311 ±20＊＊ 334 ±23＊＊100 μmol/L 294±21＊＊ 344±21＊＊ 420±17＊＊200 μmol/L 317±15＊＊ 397±25＊＊ 474±32＊＊LPS(10 μg/L) 447 ±31＊＊

表6 各組HA-VSMC中IL-8蛋白含量Table 6 The expression of IL-8 proteins in various groups of HA-VSMC，ng/L，n=3)

表6 各組HA-VSMC中IL-8蛋白含量Table 6 The expression of IL-8 proteins in various groups of HA-VSMC，ng/L，n=3)

＊P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 compared with control group．

group 6 hours 12 hours 24 hours control 253±15 254±16 254±15 50 μmol/L 297 ±21 377 ±38＊＊ 440 ±36＊＊100 μmol/L 321 ±36* 410 ±44＊＊ 474 ±42＊＊200 μmol/L 361±27＊＊ 434±42＊＊ 494±42＊＊LPS(10 μg/L) 480 ±44＊＊

表7 各組HA-VSMC中MCP-1蛋白含量Table 7 The expression of MCP-1 proteins in various groups of HA-VSMC(，ng/L，n=3)

表7 各組HA-VSMC中MCP-1蛋白含量Table 7 The expression of MCP-1 proteins in various groups of HA-VSMC(，ng/L，n=3)

＊P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 compared with control group．

group 6 hours 12 hours 24 hours control 122±7 122±8 122±7 50 μmol/L 140 ±4* 171 ±24* 188±11*100 μmol/L 152±6＊＊ 196±27＊＊ 229±13＊＊200 μmol/L 168±11＊＊ 220±25＊＊ 266±37＊＊LPS(10 μg/L) 238 ±43＊＊

Toll樣受體(Toll-like receptor，TLR)主要表達(dá)于單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞及血管平滑肌細(xì)胞等細(xì)胞中，可識(shí)別病原體相關(guān)分子模式(pathogen associated molecular patterns，PAMP)，誘導(dǎo)炎性因子釋放，在天然免疫防御中起重要作用，同時(shí)也參與了多種慢性炎性反應(yīng)疾病的病變過(guò)程。有研究發(fā)現(xiàn)，TLR4天然配體LPS可激活人冠狀動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞TLR4信號(hào)及炎性因子MCP-1、IL-6和 IL-1的表達(dá)［1－2］，提示 TLR4 信號(hào)的激活可誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生炎性反應(yīng)，可能在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中起作用。

游離脂肪酸(free fatty acid，F(xiàn)FA)是2型糖尿病和動(dòng)脈粥樣硬化形成和發(fā)展的重要致病因素，F(xiàn)FA通過(guò)多種途徑誘導(dǎo)動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂和血管平滑肌細(xì)胞增生，促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展［5－9］。國(guó)外研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)FA通過(guò)激活TLR4信號(hào)，誘發(fā)小鼠脂肪細(xì)胞和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生炎性反應(yīng)，而TLR4基因突變(TLR4－/－)則可顯著抑制FFA誘導(dǎo)的炎性反應(yīng)［10－11］。采用軟脂酸刺激體外培養(yǎng)的小鼠主動(dòng)脈或人微血管內(nèi)皮細(xì)胞，通過(guò)激活TLR4信號(hào)途徑誘導(dǎo)血管炎性反應(yīng)，而TLR4基因敲除則可防止上述變化［12］。以上研究結(jié)果表明:TLR4信號(hào)很可能在FFA導(dǎo)致的血管內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂中發(fā)揮了作用，F(xiàn)FA能否通過(guò)TLR4信號(hào)誘導(dǎo)HA-VSMC產(chǎn)生炎性反應(yīng)則未見(jiàn)報(bào)道。

油酸是人體重要的不飽和游離脂肪酸，本研究發(fā)現(xiàn):油酸對(duì)HA-VSMC的增殖具有雙向調(diào)節(jié)作用，油酸在濃度為50～200 μmol/L之間促進(jìn)細(xì)胞的增殖活性，增加油酸濃度，抑制了細(xì)胞增殖。本研究結(jié)果表明:油酸誘導(dǎo)HA-VSMC TLR4及炎性因子IL-6、IL-8和MCP-1的mRNA及蛋白表達(dá)呈時(shí)間劑量依賴性，證實(shí)FFA通過(guò)TLR4信號(hào)激活HA-VSMC產(chǎn)生炎性反應(yīng)，可能在2型糖尿病動(dòng)脈粥樣硬化和大血管病變的發(fā)生和發(fā)展中起重要作用，為今后進(jìn)一步研究炎性反應(yīng)在2型糖尿病及動(dòng)脈粥樣硬化病理發(fā)生機(jī)制中的作用提供了依據(jù)。本研究?jī)H初步證實(shí)了TLR4信號(hào)通路在FFA誘導(dǎo)HA-VSMC的炎性反應(yīng)中的作用，但是其分子機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。

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