NF-кB參與七氟烷預處理所致延遲性抗大鼠心肌缺血再灌注損傷

吳雪梅，王 琛，謝 紅，喬世剛，覃 琴，劉 霞

(蘇州大學附屬第二醫(yī)院麻醉科，江蘇蘇州215004)

吸入麻醉藥預處理(anesthetic preconditioning，APC)被證實在多種實驗動物模型中可產(chǎn)生類似缺血預處理的延遲性心肌保護作用，又稱第二保護窗(second window of protection，SWOP)［1-2］。SWOP起效緩慢而持久，時間窗寬，臨床上有充分的時間在可能產(chǎn)生心肌缺血的外科手術(shù)前給予，可更方便有效地預防圍術(shù)期心肌缺血的并發(fā)癥。目前，就SWOP具體作用機制報道較少［3-4］。研究發(fā)現(xiàn)，核轉(zhuǎn)錄因子-кB(nuclear factor-kappaB，NF-κB)信號傳導通路與心肌缺血再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)損傷、缺血預處理及一些藥物預處理的心肌保護密切相關(guān)［5-6］。因此，本研究擬通過使用NF-κB的特異性抑制劑 PTN干預，研究七氟烷 SWOP與NF-κB蛋白之間的關(guān)系，旨在證實七氟烷預處理對在體大鼠心肌的SWOP作用;并探討七氟烷SWOP的可能保護機制。

1 材料與方法

1.1 七氟烷預處理與動物模型制備

清潔級雄性SD大鼠，體質(zhì)量270～350 g［蘇州大學醫(yī)學院實驗動物中心提供，許可證號:SYXK(蘇)2007-0035］。將大鼠置入特制玻璃箱內(nèi)進行七氟烷預處理，玻璃箱進口端由Sevotec 5七氟烷揮發(fā)罐(Dr?ger Vapor 2000，Dr?ger Medical公司)持續(xù)輸入2.5%七氟烷(批號:8702，雅培制藥有限公司上海分公司)，氣體流量為3 L/min，出口端連接ULT-Ⅰ型麻醉氣體監(jiān)測儀(Datex-Ohmeda公司)監(jiān)測七氟烷、O2及CO2的濃度。吸入七氟烷1和2 h時分別進行血氣分析，后將大鼠放回籠內(nèi)正常飲食飼養(yǎng)。24 h后建立大鼠在體心肌I/R損傷模型［7］。

1.2 實驗分組與處理

1.2.1 心肌梗死范圍部分:48只大鼠，隨機分為6組(n=8)。對照組(CON組)和單純?nèi)毖M(I/R組)吸入空氣2 h;PTN和DMSO組于吸入空氣前15 min腹腔內(nèi)注射PTN(500 μg/kg)和PTN的溶劑DMSO;七氟烷預處理組(SWOP組)吸入2.5%七氟烷2 h;PTN+SWOP組于七氟烷預處理前15 min腹腔內(nèi)注射PTN，I/R和SWOP組于吸入氣體前15 min腹腔內(nèi)注射相等容量的0.9%氯化鈉注射液作為對照。各組大鼠均于24 h后建立I/R損傷的在體模型(CON組建立模型后不采取任何手術(shù)和干預)，實驗中監(jiān)測并記錄血液動力學變化，實驗結(jié)束用氯化三苯四氮唑染色法測定左心室心肌梗死范圍。

1.2.2 蛋白部分:1)未缺血部分:48只大鼠隨機分為6組(n=8)，即CON、SWOP、七氟烷對照組(SEVO組)、DMSO、PTN和PTN+SWOP組，所有處理同1.2.1，于大鼠心肌缺血前或相應時間點取左心室心肌標本。SEVO組七氟烷預處理24 h后建立模型，不經(jīng)歷缺血再灌注3 h(30 min平衡期+30 min缺血期+2 h再灌注期)后取心肌標本。2)再灌注后部分:取48只雄性SD大鼠，隨機分為6組(n=8)，CON、I/R、SWOP、DMSO、PTN 和 PTN+SWOP組。所有處理同1.2.1，分別于大鼠心肌缺血再灌注后或相應時間點取心肌標本。

1.3 在體大鼠心肌梗死范圍的測定

心肌缺血再灌注結(jié)束后即刻再次阻斷左冠狀動脈前降支(LAD)，頸內(nèi)靜脈注射5%伊文思藍使心臟正常區(qū)域藍染，迅速取出心臟，分離左心室并用心臟切割器橫斷分割成5～6塊2 mm厚的組織。分離藍染的正常組織，將未染色的危險區(qū)組織置于0.5%TTC中，37℃水浴15 min，10%甲醛固定過夜。梗死區(qū)被染為灰白色，顯微鏡下分割并稱重，心肌梗死范圍以梗死區(qū)心肌重量占缺血區(qū)心肌重量的百分比表達。

1.4 Western blot法蛋白檢測

采用 Western blot法測定 NF-кB(P65，P50)蛋白表達［8］。

1.5 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計處理。計量資料以均數(shù)±標準差)表示，組內(nèi)比較采用重復測量數(shù)據(jù)的方差分析，組間比較采用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 血液動力學結(jié)果

平衡期，各組各指標間差異無統(tǒng)計學意義。與平衡期相比，除CON組外各組再灌注1和2 h時平均動脈壓(MAP)和心率收縮壓乘積(RPP)降低(P＜0.05)(表1)。

2.2 梗死面積結(jié)果:

與I/R組(54% ±9%)相比，SWOP組(35% ±2%)的心肌梗死范圍減少(P＜0.05)(表2)。

表1 5組大鼠實驗期間的血液動力學指標變化的比較Table 1 Haemodynamics comparison of five groups during experimental session，n=8)

表1 5組大鼠實驗期間的血液動力學指標變化的比較Table 1 Haemodynamics comparison of five groups during experimental session，n=8)

＊P ＜0.05 compare with baseline group(1 mmHg=0.133 kPa).

reperfusion 1 hour 2 hours HR(min-1 group baseline 15 min before Ischemia 15 min after Ischemia)CON 372±54 363±31 365±38 361±32 352±30 I/R 375±52 366±33 367±45 358±38 357±33 SWOP 371±57 369±46 378±38 363±29 351±37 DMSO 367±59 357±38 371±53 346±23 350±41 PTN 367±40 353±35 363±30 363±35 357±40 PTN+SWOP 375±56 371±60 372±50 360±57 359±48 MAP(mmHg)CON 105±19 107±15 100±21 99±16 101±20 I/R 107±17 105±18 99±28 76±14* 71±17*SWOP 108±16 114±20 113±18 80±11* 70±12*DMSO 105±21 110±23 108±26 77±19* 68±12*PTN 109±16 100±17 102±12 72±14* 68±16*PTN+SWOP 110±19 117±25 113±24 75±12* 67±17*RPP(min-1mmHg·103)CON 48±6 47±5 46±14 45±3 47±6 I/R 47±9 44±8 45±12 34±5* 32±7*SWOP 45±7 52±2 49±5 37±7* 32±6*DMSO 46±7 46±8 45±10 33±3* 30±6*PTN 50±8 43±7 40±6 32±5* 32±5*PTN+SWOP 46±12 50±12 49±9 35±4* 30±4*

表2 6組心肌梗死范圍的比較Table 2 Myocardial infarct size of five groups，n=8)

表2 6組心肌梗死范圍的比較Table 2 Myocardial infarct size of five groups，n=8)

*P＜0.05 compare with I/R group.

group left ventricular(mg)area at risk(mg)infarct area(mg)area at risk/left ventricular(%)infarct/left ventricular(%)infarct size(%of area at risk)508±52 190±52 100±29 38±9 20±6 53±5 CON 520±31 - - - - -I/R 507±17 180±33 97±20 35±6 19±3 54±9 SWOP 569±37 204±82 74±28* 36±14 13±5* 35±2*DMSO 527±35 200±34 98±22 40±6 19±4 49±5 PTN 514±37 181±35 96±22 35±7 19±5 53±10 PTN+SWOP

2.3 Western blot檢測結(jié)果

2.3.1 未缺血部分:SWOP和 SEVO組 NF-кB(P65，P50)蛋白表達高于CON組(P＜0.05);DMSO、PTN 和 PTN+SWOP 組 NF-кB(P65，P50)蛋白表達低于SWOP組(P＜0.05)(圖1、2)

2.3.2 再灌注后部分:各組NF-кB(P65，P50)蛋白表達較CON組均上調(diào)(P＜0.05);SWOP組NF-кB(P65，P50)蛋白上調(diào)幅度低于I/R組(P＜0.05);DMSO、PTN 和 PTN+SWOP 組 NF-кB(P65，P50)蛋白表達高于SWOP組(圖1、2)

3 討論

采用經(jīng)典阻斷冠狀動脈血流方法，建立大鼠在體心肌I/R損傷模型，結(jié)合本課題組前期七氟烷SWOP在大鼠離體 Langendorff模型中的研究結(jié)果［2，9］，并根據(jù)文獻報道吸入異氟烷2 h可在大鼠在體心肌I/R損傷模型中產(chǎn)生SWOP作用［10］，最終選擇七氟烷SWOP的吸入時間為2 h。七氟烷預處理期間，采取尾動脈置管進行血氣分析，監(jiān)測大鼠PCO2和PaO2，觀察是否有低氧血癥或高二氧化碳血癥的發(fā)生。結(jié)果顯示:采用1MAC(2.5%)的七氟烷對大鼠進行預處理2 h，大鼠的循環(huán)和呼吸系統(tǒng)均處于穩(wěn)定的正常生理狀態(tài)，說明本研究的動物模型穩(wěn)定，實驗方法可靠。

實驗將心肌危險區(qū)面積控制在35%左右，排除了由于缺血范圍的差異而導致心肌梗死范圍、蛋白變化的實驗誤差，以保證結(jié)果的可靠性。結(jié)果顯示:SWOP組梗死范圍較I/R組減小，證明七氟烷預處理對大鼠心肌I/R損傷具有SWOP作用。而在七氟烷預處理前給予PTN可阻斷其保護作用，推測NF-кB至少部分參與了七氟烷SWOP的保護機制。

吸入異氟烷觸發(fā)的氧化應激啟動了早期應答基因的合成(如:NF-κB)，隨后指導參與KATP通道激活介導的心肌 SWOP作用的蛋白表達［11］。應用NF-κB的抑制劑DDTC能消除有NO信號傳導通路介導的APC的SWOP作用［12］。本研究Western blot結(jié)果亦顯示:I/R后，I/R和 SWOP組較 CON組NF-кB蛋白表達均上調(diào);SWOP組蛋白上調(diào)幅度低于I/R組;PTN+SWOP組蛋白表達較I/R組無差異。即在七氟烷預處理期前給予NF-кB特異性抑制劑PTN，使再灌注后NF-кB蛋白大量表達，造成心肌I/R損傷，阻斷了七氟烷預處理SWOP作用。從蛋白水平進一步證實，NF-кB參與了七氟烷預處理的SWOP作用機制。

本研究新見解在于，七氟烷預處理可下調(diào)24 h后大鼠心肌 I/R后期 NF-κB，減輕I/R損傷，產(chǎn)生SWOP作用。相信隨著對NF-κB信號通路的深入研究，可望闡明APC等相關(guān)心肌延遲性保護作用機制，進一步理解和掌握I/R損傷的發(fā)病過程，為臨床抗心肌缺血藥物預處理找一個新靶點。

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