環(huán)介導等溫擴增技術及其在病原微生物檢測中的應用

肖維威，周琳華，鄭文嶺，馬文麗

(南方醫(yī)科大學基因工程研究所，廣東廣州510515)

隨著生物醫(yī)藥科學的迅猛發(fā)展，檢測技術越來越受到重視。核酸擴增是生命科學中最重要的檢測手段之一，目前已廣泛應用于臨床醫(yī)學診斷和傳染病病原體檢測等領域。核酸擴增技術主要分為以常規(guī)PCR為基礎的變溫擴增技術以及恒溫擴增技術兩大類。常規(guī)PCR包括單一PCR、多重PCR、巢式PCR和實時熒光定量PCR等，恒溫擴增技術包括核酸序列依賴擴增(nucleic acid sequence-based amplification，NABSA)、滾環(huán)DNA擴增(rolling circle DNA amplification，RCA)、指數(shù)式擴增反應(exponential amplification reaction，EXPAR)、連接酶鏈擴增反應(ligase chain reaction，LCR)、鏈置換擴增反應(strand displacement amplification，SDA)和環(huán)介導等溫擴增(loop mediated isothermal amplification，LAMP)技術等。因PCR的變溫過程使其對儀器精密度要求較高，操作時間相對較長，從而導致PCR無法推廣至基層。因此，恒溫擴增成為核酸擴增技術的一個研究熱點，環(huán)介導等溫擴增技術就是其中一種。

環(huán)介導等溫擴增技術又稱為環(huán)介導恒溫擴增技術，是由Notomi等［1］于2000年開發(fā)的一種新穎的恒溫核酸擴增方法。憑借其高效、快速、特異、低廉、易檢測、易操作等特點，從問世以來，短短十幾年，即在各種病原體、病毒快速檢測、動植物檢疫等方面嶄露頭角，尤其在傳染性疾病診斷中發(fā)揮了極大作用。隨著該技術體系的完善與發(fā)展，其在分子檢測領域的應用也必將越來越廣泛與深入。

1 LAMP技術的原理

1.1 LAMP的技術原理

LAMP技術針對靶序列的6個特異性區(qū)域設計2對引物，利用一種具有鏈置換活性的DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)在等溫條件(65℃左右)保溫30～60 min，即可擴增出109拷貝靶序列，并且伴有肉眼可見的副產物白色焦磷酸鎂沉淀產生。

1.2 引物組成

LAMP的2對引物分別稱為FIP、BIP、F3和B3，可識別靶基因的6個不同區(qū)域。F3:上游外部引物，由F3區(qū)組成，并與靶基因的F3c區(qū)域互補。B3:下游外部引物，由B3區(qū)域組成，和靶基因的B3c區(qū)域互補。FIP:上游內部引物，由F2區(qū)和F1c區(qū)域組成，F(xiàn)2區(qū)與靶基因3'端的F2c區(qū)域互補，F(xiàn)1c區(qū)與靶基因5'端的Flc區(qū)域序列相同，兩者之間以TTTT連接。BIP:下游內部引物，由B1c和B2區(qū)域組成，B2區(qū)與靶基因3'端的B2c區(qū)域互補，B1c區(qū)域與靶基因5'端的Blc區(qū)域序列相同，兩者之間以TTTT連接(圖1)。

1.3 引物設計原則

由于LAMP是通過2對引物與6個不同區(qū)域的相互識別來產生擴增效應，因此引物設計要求比較高。LAMP引物設計一般選取一段長約130～200 bp(最長300 bp，不可超過500 bp)的保守序列作為靶序列。引物設計需要遵循以下原則:1)要保持引物的退火溫度約55～66℃，其中F1c和B1c的Tm值最高(64～66℃)，F(xiàn)2和B2次之(59～61℃)，F(xiàn)3和B3最低(55～60℃);GC含量高者，取Tm范圍較高值;而AT含量高者，取Tm范圍較低值。2)B1c、F2和F3與靶保守序列(5'→3'方向)的相應部分相同，F(xiàn)1c、B2和B3與靶保守序列的相應部分反向互補。3)F2的前端與B2之間相距120～180 bp，F(xiàn)2的前端與F3及B2的前端與B3之間相距0～20 bp，F(xiàn)2的前端與F1c及B2的前端與B1c之間相距40～60 bp。4)避免引物二級結構形成，特別是3'端不應存在富AT區(qū)，不能與其他引物互補。5)GC含量在40% ～65%之間，以50% ～60%為最佳。

具體設計時，采用在線LAMP引物設計軟件Primer Explorer 3.0(或4.0)http://primerexplorer.jp/e，并結合DNAstar的MegAlign模塊和Primer 5.0對引物進行綜合比較，防止產生引物二聚體。還可以利用在線BLAST，將設計好的引物在Gen-Bank中進行比對確認，以保證引物的特異性。

2 LAMP技術的特點

LAMP之所以被很多科學家認為可以替代PCR技術在于其有幾大突出特點:

2.1 高效性

LAMP反應不需要雙鏈DNA的預熱變性，避免了溫度循環(huán)造成的時間損失。核酸擴增一般在1 h內均可完成。在穩(wěn)定的體系中添加環(huán)引物后，時間更可以縮短到原來的1/2，多數(shù)情況在20～30 min即有擴增產物可被檢測。這對于快速診斷十分重要，便于患者即時獲得臨床檢驗結果，醫(yī)生及時決定治療方案。

圖1 LAMP引物設計示意圖Fig 1 The schematic diagram of LAMP primers

2.2 高靈敏性

與定性PCR相比，LAMP法的檢測率要比其高出1～2個數(shù)量級，具有real-time TaqMan PCR同樣的敏感性，能滿足低拷貝數(shù)樣品的檢測，擴增產物靶序列可達到109以上。有研究［2］發(fā)現(xiàn)，加環(huán)引物的敏感性要比沒有加環(huán)引物的高出7個數(shù)量級，在極低模板量(0.01 PFU)即可獲得結果。

2.3 高特異性

由于是針對靶序列6個區(qū)域設計4條特異性引物，6個區(qū)域中任何區(qū)域與引物不匹配均不能進行核酸擴增，故其特異性極高。

2.4 操作簡單

擴增結果判定不需要對產物進行電泳，而可直接用肉眼觀察擴增管濁度，或通過向其擴增產物中添加熒光染料再通過顏色變化來判定結果，使結果可視化，操作更簡單。

2.5 成本低廉

LAMP核酸擴增是在等溫條件下進行，只需要恒溫水浴鍋即可，不需要特殊的試劑及儀器，適合大規(guī)模篩檢和基層疾病檢測。

3 LAMP法的進展

鑒于LAMP技術相比于其他核酸擴增方法具有以上多種優(yōu)點，人們在許多方面對其更進行了改進和研究，使其更加簡便快速，以便更適于臨床檢測的要求。LAMP法的進展主要包括:

3.1 檢測模板的拓展

除對DNA檢測外，LAMP也可對RNA分子進行檢測。RT-LAMP的擴增原理與LAMP相同，只是在反應體系中增加了反轉錄試劑，使RNA的反轉錄和LAMP擴增在同一試管中完成，而不需要分步進行［3－5］。2008 年，Kelly 等［6］研究發(fā)現(xiàn)，LAMP 法對模板要求不高，可直接用于某些病原微生物樣本的檢測，而無需對樣本中的核酸進行提取純化，這使LAMP技術在臨床應用中更加簡便［7］。

3.2 反應速度改進

LAMP是恒溫擴增，沒有溫度變化的時間損耗，一般60～90 min即可完成擴增反應，能基本滿足臨床病原微生物快速檢測的要求，但相比臨床常用的ELISA等免疫學技術，所需時間還是較長，因此人們進行了加快反應速度的研究。2005年，Yoshida等［2］通過在反應體系中添加2條環(huán)引物的方法使反應速度大大提高，反應時間縮短一半，在30 min內即可完成反應。

3.3 產物鑒定方法

對于LAMP擴增產物的檢測通常有3種方法:1)經瓊脂糖電泳，EB染色觀察梯度條帶。LAMP反應中的產物是一系列具有不同莖長度的莖環(huán)結構DNA和帶有許多環(huán)的類似花椰菜結構的DNA混合物，因此當用凝膠電泳分析時，會產生特異的梯狀條帶。2)肉眼觀察。在產物中加入SYBR GreenⅠ，變成綠色說明有擴增產物，沒有變色說明無擴增產物。3)間接通過對LAMP擴增副產物焦磷酸鎂白色沉淀形成的渾濁程度進行判斷。目前，這種方法已被改進并成功開發(fā)出一種實時濁度檢測儀［8］，它也可以用于對靶序列進行定量分析。

3.4 與其他技術聯(lián)合應用

LAMP技術在建立之后，人們利用其敏感、簡便、快速的特點，將其與其他的技術進行聯(lián)合，開發(fā)了很多有效的檢測方法。2004年，Hataoka等［9］將LAMP法與電泳結合，制成聚丙烯酰胺凝膠基因芯片，用來檢測和分析特異性基因類型。2003年，Maruyama等［10］把LAMP和原位雜交相結合，建立原位LAMP(in-situ LAMP)，用于檢測組織細胞中大腸桿菌O157∶H7。2006年申建維等［11］在檢測耐甲氧西林金黃色葡萄球菌時，將核酸雜交和LAMP技術進行結合，用多重LAMP同時擴增金黃色葡萄球菌耐藥基因mecA和femA。結果該方法的最低檢測限為10 CFU/mL，與藥敏試驗結果相比較，靈敏度為99.0%，特異性為90.9%，證明該方法靈敏度高，特異性強，操作簡便快速，適用于臨床病原微生物的快速檢測。

4 LAMP在病原微生物檢測中的應用

4.1 細菌的檢測

首先將LAMP用于細菌檢測的是Maruyama等［10］，他們用該技術成功檢測了大腸桿菌O157∶H7細胞中stxA2基因。Maed等［12］針對引起牙齦炎的病原菌16S rRNA基因建立了LAMP技術，可在30 min內檢測出含有20個細菌的擴增子，產物不需要進行電泳，只要向擴增產物中添加熒光染料SYBY GreenⅠ，通過肉眼觀察直接判定結果，是一種診斷口腔傳染性疾病的有效快速診斷方法。朱杰儀等［13］根據不同血清型副豬嗜血桿菌的16S rRNA高度保守區(qū)域，建立了LAMP檢測方法，反應可在1 h內完成，比PCR敏感100倍。目前LAMP還成功地用于特異檢測炭疽芽孢桿菌［7］、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌［11］、霍亂弧菌［14］、肺炎鏈球菌［15］等細菌類病原微生物。通過對眾多細菌研究結果表明，與傳統(tǒng)PCR相比，LAMP技術不僅快速、敏感，而且具有良好的特異性。

4.2 病毒的檢測

Enomoto等［16］及 Kaneko 等［17］采用 LAMP 方法擴增7型人類皰疹病毒(HHV-7)DNA，并采用焦磷酸鎂濁度法進行檢測。結果反應30 min后LAMP的檢測靈敏性為每管500拷貝，60 min的靈敏性為每管250拷貝，而HHV-6A、HHV-6B和巨細胞病毒(HCMV)均未出現(xiàn)擴增反應。自用LAMP成功地檢測了人類皰疹病毒之后，又用LAMP對單純皰疹病毒［18］、水痘帶狀皰疹病毒［19］、乙肝病毒［20］實現(xiàn)了檢測。

在同一反應管中加入反轉錄酶和DNA聚合酶，還可以對RNA病毒進行RT-LAMP擴增檢測。2009年Hosaka等［21］利用RT-LAMP對HIV-1M組進行檢測，擴增反應在35 min內即可完成，檢測限達到120拷貝/mL。從57名感染HIV-1的患者和40名未感染HIV-1的居民體內收集血漿樣品進行RT-LAMP分析，結果與預期完全一致。由此可見，RT-LAMP分析在HIV診斷上快速靈敏，尤其適用于資源條件不足的環(huán)境。此外，對狂犬病病毒［22］、日本乙型腦炎病毒［23］、馬爾堡病毒［24］、禽流感病毒［25］等進行 RT-LAMP 檢測的方法也已建立起來，并得到不斷深入的研究。

4.3 寄生蟲的檢測

原生動物寄生蟲是人類重要而常見的病原體，嚴重危害人類健康?；贚AMP技術的特點，其在原生動物寄生蟲檢測方面也得到了廣泛應用。2012年易海華等［26］針對感染人的4種瘧原蟲(惡性瘧原蟲、三日瘧原蟲、卵形瘧原蟲、間日瘧原蟲)的18S rRNA基因共有保守序列，建立了定量的環(huán)介導等溫擴增基因檢測方法。該法可特異區(qū)分檢測上述4種瘧原蟲與12種相關寄生蟲，與PCR方法相比，LAMP檢測方法的敏感性是其10倍，檢出限達到1.42×101拷貝/μL，適合瘧疾防治檢測的需要。目前 LAMP 還廣泛地應用于錐蟲［27］、弓形蟲［28］、血吸蟲［29］等的檢測。

5 展望

目前LAMP技術的研究主要集中在產物檢測的方便性和反應速度上，各國科技工作者都在努力提高反應速度、縮短反應時間、找到簡便的產物檢測方法，以更好地應用于基層臨床診斷和現(xiàn)場檢測。憑借其操作簡單、特異性強、可以在短時間內快速獲得大量特異性擴增產物、擴增產物易判斷、不需要昂貴的儀器和試劑等優(yōu)點，LAMP技術非常適用于臨床即時、快速簡便的大樣本量檢測要求，必將成為核酸研究領域的重要工具，在病原微生物檢測領域有著非常廣泛的應用前景。

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