腦必通膠囊對局灶性腦缺血大鼠腦血流量及內(nèi)皮細(xì)胞iNOS表達(dá)的影響

秦媛媛， 楊 磊， 張慧靈， 沈夕坤

(1.蘇州中醫(yī)醫(yī)院，江蘇 蘇州 215009;2.蘇州大學(xué)藥理學(xué)教研室，腦血管病藥理研究室，江蘇 蘇州 215123)

腦中風(fēng)是一組以腦部缺血及出血性損傷癥狀為主要臨床表現(xiàn)的疾病，又稱腦卒中或腦血管意外，主要分為出血性腦中風(fēng) (腦出血或蛛網(wǎng)膜下腔出血)和缺血性腦中風(fēng)(腦梗死、腦血栓形成)兩大類，以腦梗死最為常見。目前中醫(yī)對于缺血性腦中風(fēng)常用活血化瘀、益氣活血等藥物進(jìn)行治療［1］。腦必通膠囊是由紅景天、三七、川芎和銀杏葉四味中藥組成的復(fù)方制劑，每種成分從天然植物的提取物精制而成，有助于促進(jìn)血?dú)庋h(huán)、活腦寧神。本實(shí)驗(yàn)室前期工作已證明腦必通膠囊對大鼠永久性大腦中動脈阻塞所致的腦中風(fēng)具有保護(hù)作用 (待發(fā)表)。但腦必通膠囊對腦血流量及其血管內(nèi)皮細(xì)胞是否有影響，尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)探討腦必通膠囊對局灶性腦缺血大鼠腦血流量的影響及其誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)型一氧化氮合酶 (iNOS)表達(dá)的機(jī)制。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動物及細(xì)胞 SD大鼠，雄性，體質(zhì)量280～310 g，清潔級。由蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供［生產(chǎn)許可證 XCYK(蘇):2002－2008)，使用許可證 SYXK(蘇):2002－0037］。人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞 (HUVEC)由ScienCell研究室提供。

1.2 藥物及試劑 腦必通膠囊，香港保健協(xié)會提供，批號為3GB081001。實(shí)驗(yàn)前用0.5% 羧甲基纖維素鈉 (CMC)配制。紅四氮唑 (TTC)，由國藥生產(chǎn)，批號:RA1881;水合氯醛，五聯(lián)化工廠 (中國上海)，批號:w20021122;多聚甲醛，天津市化學(xué)試劑研究所產(chǎn)品，批號:20020308，iNOS兔多克隆抗體，武漢博士德公司產(chǎn)品。

1.3 儀器 電子天平 (AL104 Mettler-Toledo公司)。動物腦立體定位儀;激光多普勒血流儀 (ML191 ADInstruments公司);缺氧培養(yǎng)氣室 (MIC-101，Billups-Rothenberg);電泳儀 (power PAC 2000，Biorad公司);X光自動洗片機(jī)(X-OMAT2000，美國KODAK公司);離心機(jī) (5810R，德國Eppendorf公司);基因擴(kuò)增儀 (MyCycler Thermal Cycler，美國BIORAD公司)。

2 方法

2.1 分組和給藥 取60只SD雄性大鼠，體質(zhì)量 (280±20)g，蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供。隨機(jī)分成6組，每組10只。(1)對照組:每天灌以0.5%CMC，假手術(shù)后24 h處死。(2)模型組:缺血24 h后處死。(3)腦必通大劑量組:按350 mg/(kg·d)劑量灌胃;腦必通中劑量組:按175 mg/(kg·d)劑量灌胃;腦必通小劑量組:按87.5 mg/(kg·d)劑量灌胃。(4)復(fù)方丹參滴丸陽性對照組:按67.5 mg/(kg·d)灌胃。各組均以1 mL/100 g體積灌服，連續(xù)7 d，末次給藥2 h后進(jìn)行手術(shù)，用于實(shí)驗(yàn)。

2.2 對永久性大腦中動脈阻塞 (pMCAO)模型大鼠腦血流量的影響 將麻醉大鼠頭部固定于腦立體定位儀上，沿顱骨正中偏右切開皮膚及皮下組織，在大鼠前囟后1.5 mm，中線右側(cè)旁開5 mm處鉆一個(gè)直徑1 mm的小孔，該點(diǎn)為大腦中動脈缺血中心區(qū)［2］。沿小孔插光纖探頭到大腦皮層表面，用血流儀配套的固定器固定光纖探頭，監(jiān)測腦中動脈缺血 (MCAO)前的基礎(chǔ)值 (手術(shù)前)、MCAO后腦血流值 (手術(shù)后)，穩(wěn)定5 min后開始記錄數(shù)據(jù)。

2.3 含藥血清的制備 SD大鼠隨機(jī)分成4組，每組3只，即 (1)正常對照組;(2)腦必通膠囊0.44 g/kg組 (小劑量);(3)腦必通膠囊0.88 g/kg組 (中劑量);(4)腦必通膠囊1.76 g/kg組 (大劑量)。

每組按1 mL/100 g灌胃，每天2次，連續(xù)3 d，第4天灌藥后1 h，乙醚麻醉，腹主動脈取血，3 000 r/min離心10 min，取血清，經(jīng)56℃ 30 min滅活后，過濾滅菌，－80 ℃保存?zhèn)溆茫?］。

2.4 氧糖剝奪模型的建立 先將培養(yǎng)HUVEC細(xì)胞的培養(yǎng)液換成無糖DMEM培養(yǎng)基，然后轉(zhuǎn)移置缺氧培養(yǎng)氣室中，同時(shí)打開有白色塑料鉗夾的聚丙烯管道的進(jìn)氣口和出氣口，將入口處的聚丙烯管道于包含有所需的混合氣體的源頭相連，向氣室內(nèi)充入95%的N2和5%的CO2氣體，將氣流自動控制在每分鐘20 L，大約4 min氣室被完全充滿后，切斷氣體來源，關(guān)上白色的塑料鉗夾以緊閉氣室，最后將這個(gè)氣室置于37℃溫育。氧糖剝奪的時(shí)間分別是1、3、6、12、24 h。

2.5 Real-Time PCR HUVEC細(xì)胞經(jīng)氧糖剝奪處理后，利用TRIzol法提取總RNA，紫外分光光度計(jì)測定RNA量。本實(shí)驗(yàn)采用的引物由寶生物工程 (大連)有限公司設(shè)計(jì)，上海皓嘉生物科技有限公司合成。引物序列如下:

HUVEC細(xì)胞經(jīng)氧糖剝奪處理后3 h，收集置離心管，1 200 r/min離心5 min。棄上清并將其轉(zhuǎn)移至EP管中，加入1 mL trizol室溫靜置5 min，12 000 r/min 4℃離心5 min。小心吸取上清液，移入新的離心管中 (切勿吸取沉淀)。小心吸取上清液，向EP管中加入三氯甲烷 (RNAiso Reagent的1/5體積量)，蓋緊離心管蓋，用力震蕩。待充分乳化溶液呈乳白狀后，室溫靜置5 min。從離心機(jī)中小心取出離心管，此時(shí)勻漿液分為三層，即無色的上清液、中間的白色蛋白層及帶有顏色的下層有機(jī)相。吸取上清液轉(zhuǎn)移至另一新的離心管中。向上清中加入等體積的異丙醇，上下顛倒離心管充分混勻后，在15～30℃下靜置 10 min，離心。

2.6 Western Blotting HUVEC細(xì)胞經(jīng)氧糖剝奪處理后，用超聲波細(xì)胞破碎儀在冰浴下超聲裂解細(xì)胞，－80℃ 保存?zhèn)溆?。? μL蛋白質(zhì)溶液，用BCA蛋白定量試劑盒測定以上所提取的蛋白濃度，調(diào)整上樣量，使各組蛋白總量一致，按次序上樣，安排已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)物，電泳結(jié)束后，用蛋白轉(zhuǎn)移裝置將蛋白轉(zhuǎn)到硝酸纖維素膜上，按轉(zhuǎn)移蛋白的常規(guī)方法進(jìn)行。

轉(zhuǎn)移終了，凝膠進(jìn)行蛋白染色液染色、脫色液脫色，以確定膠中蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)移情況。膜用TBST漂洗后。轉(zhuǎn)移結(jié)束后，以TBST洗膜，室溫?fù)u動。將硝酸纖維素膜加入封閉液中置常溫?fù)u動。封閉結(jié)束后，將硝酸纖維素膜放入一塑料袋中，按每平方厘米膜加0.1 mL一抗溶液 (iNOS稀釋度為1∶500，5%脫脂牛奶溶于TBST中)，混勻后裝入袋中，去除帶內(nèi)所有氣泡，用封膜機(jī)封上開口，4℃過夜。棄去反應(yīng)液，TBST洗3次，每次10 min。在膜上加入二抗:IgG-HRP溶液 (1∶5 000，5%脫脂牛奶溶于 TBST中)，室溫下輕輕振蕩1 h取出膜，在PBS中洗膜3次，每次10 min。ECl顯色，壓片。

2.7 免疫熒光法 HUVEC細(xì)胞經(jīng)氧糖剝奪處理后，用PBS洗滌3次;每孔加入1%BSA，室溫下避光搖1 h;每組相應(yīng)各孔加入相應(yīng)蛋白的第一抗體iNOS(1∶400)，室溫下振搖1 h，4℃孵育過夜;用PBS漂洗3次，加第二抗體，室溫下振搖1 h，PBS漂洗3次，貼片，封片，熒光顯微鏡和共聚焦顯微鏡下觀察，攝片。

3 結(jié)果

3.1 對pMCAO大鼠局部相對腦血流量的影響 假手術(shù)組大鼠腦血流量無明顯改變。腦必通膠囊 175 mg/kg、350 mg/kg給藥7 d后顯著增加大鼠的基礎(chǔ)局部相對腦血流量(rCBF)(圖A1～A6，1B)。模型組rCBF降低至術(shù)前的9.79%，腦必通膠囊 87.5 mg/kg、175 mg/kg、350 mg/kg組rCBF分別降低至術(shù)前的13.35%、14.73%、16.66%，與模型組相比，腦必通膠囊中、大劑量組具有顯著性差異(圖1A，圖1C;P＜0.05，P＜0.01)。腦必通小劑量組pMCAO后與模型組比較亦有增高趨勢，但未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著水平 (圖1A1～A6，圖1C)，提示腦必通膠囊可以增加大鼠基礎(chǔ)及pMCAO后腦血流量。見圖1。

3.2 HUVEC細(xì)胞氧糖剝奪后iNOS mRNA表達(dá)時(shí)程變化及腦必通膠囊含藥血清對iNOS mRNA的表達(dá)影響 Real-Time PCR結(jié)果顯示:對照組HUVEC細(xì)胞iNOS mRNA表達(dá)較少，HUVEC細(xì)胞氧糖剝奪3 h，iNOS mRNA表達(dá)顯著增加(P＜0.01)，氧糖剝奪6 h、12 h、24 h iNOS mRNA表達(dá)較對照仍有較高表達(dá) (P＜0.05)。結(jié)果見圖2A。

為了證明腦必通膠囊含藥血清能否上調(diào)HUVEC細(xì)胞氧糖剝奪后iNOS mRNA的表達(dá)，采用Real-Time PCR觀察腦必通膠囊含藥血清對HUVEC細(xì)胞氧糖剝奪后iNOS mRNA表達(dá)的影響。結(jié)果證明:對照組HUVEC細(xì)胞iNOS mRNA表達(dá)較少，HUVEC細(xì)胞氧糖剝奪3 h iNOS mRNA表達(dá)較對照顯著上調(diào) (P＜0.05，P＜0.01)，腦必通膠囊含藥血清大、中劑量組iNOS mRNA的表達(dá)較模型組顯著上調(diào)(P＜0.01)。結(jié)果提示:腦必通膠囊含藥血清可上調(diào)HU-VEC細(xì)胞氧糖剝奪后iNOS mRNA的表達(dá)。結(jié)果見圖2B。

圖1 相對腦血流量的變化

3.3 HUVEC細(xì)胞氧糖剝奪后iNOS蛋白表達(dá)的時(shí)程變化以及腦必通膠囊含藥血清對iNOS蛋白表達(dá)的影響 Western blotting結(jié)果顯示:對照組HUVEC細(xì)胞iNOS的蛋白量較低，氧糖剝奪處理組iNOS的蛋白量顯著增加 (P＜0.01)，氧糖剝奪3 h、6 h、12 h組與對照組比較有顯著性差異 (P＜0.01)，其中氧糖剝奪12 h組，iNOS的蛋白量到達(dá)高峰，氧糖剝奪24 h組iNOS蛋白量下降至接近于對照組水平。結(jié)果見圖3A，3C。

Western blotting結(jié)果同樣顯示:對照組HUVEC細(xì)胞iNOS的蛋白量較低;氧糖剝奪3 h、6 h、12 h組iNOS的蛋白量顯著增加 (P＜0.01);其中氧糖剝奪12 h組iNOS的蛋白量最高，腦必通膠囊含藥血清中、大劑量組可顯著增加iNOS的蛋白量 (P＜0.01)，并呈現(xiàn)較好的劑量依賴性。提示腦必通膠囊含藥血清可增加HUVEC細(xì)胞氧糖剝奪后的iNOS蛋白量。結(jié)果見圖3B，3D。

免疫熒光結(jié)果顯示:對照組HUVEC細(xì)胞iNOS的表達(dá)量少，熒光極弱，主要分布在細(xì)胞漿;氧糖剝奪1 h組iNOS胞漿表達(dá)明顯增強(qiáng)，核內(nèi)可見少量熒光;氧糖剝奪3 h組iNOS胞漿內(nèi)熒光強(qiáng)度增加，部分細(xì)胞胞核內(nèi)可見較多熒光顆粒，氧糖剝奪6 h、12 h組，細(xì)胞漿內(nèi)熒光更強(qiáng)，細(xì)胞核內(nèi)可見大量熒光顆粒，以氧糖剝奪12 h組表達(dá)最強(qiáng);氧糖剝奪24 h后熒光變?nèi)?，彌散在?xì)胞內(nèi)，但仍可見細(xì)胞核內(nèi)有熒光顆粒。結(jié)果見圖4A。

圖3 HUVEC細(xì)胞氧糖剝奪后iNOS蛋白水平的表達(dá)以及腦必通膠囊對iNOS蛋白表達(dá)的影響

圖4 HUVEC細(xì)胞氧糖剝奪后iNOS的表達(dá)以及腦必通膠囊對iNOS表達(dá)的影響

免疫熒光結(jié)果顯示:對照組HUVEC細(xì)胞iNOS的表達(dá)量少，熒光極弱，主要分布在細(xì)胞漿;氧糖剝奪12 h組，細(xì)胞核內(nèi)可見大量熒光顆粒，細(xì)胞漿內(nèi)熒光強(qiáng)度顯著增加，腦必通膠囊含藥血清大、中劑量組可顯著增加細(xì)胞內(nèi)iNOS的熒光強(qiáng)度，大劑量組熒光顆粒增多明顯 (P＜0.01，P＜0.05)。提示腦必通膠囊含藥血清可增強(qiáng)HUVEC細(xì)胞氧糖剝奪后所致的iNOS的表達(dá)。結(jié)果見圖4B。

4 討論

腦必通膠囊是用天然植物川芎、銀杏葉等提取物精制而成，其總黃酮量達(dá)26.7%，有助于促進(jìn)血?dú)庋h(huán)、活腦寧神。雖然對中藥防治腦缺血的研究較多，但目前關(guān)于腦必通膠囊對局灶性腦缺血大鼠腦血流量的影響及其誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞iNOS的表達(dá)的機(jī)制，尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。

當(dāng)腦血流降低到代謝物質(zhì)的運(yùn)輸不足以滿足代謝的需要時(shí)，即發(fā)生腦缺血損傷。腦缺血的中心問題是氧和能量的耗竭，因此及早增加腦組織氧和血液的供應(yīng)量是防治缺血性腦損傷的關(guān)鍵。應(yīng)盡早改善并維持缺血組織局部有效的供血，改善腦微循環(huán)障礙，減輕神經(jīng)元損傷［4］。激光多普勒血流測量 (LDF)可以無損傷性的快速反饋血流量的變化信息，可以連續(xù)、實(shí)時(shí)加監(jiān)測神經(jīng)組織微循環(huán)血流量，其測量范圍小，可以精確的動態(tài)反映局部組織的微循環(huán)的血流動力學(xué)［5］。本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用大鼠pMCAO模型研究了腦必通膠囊對腦缺血的影響，發(fā)現(xiàn)預(yù)先給藥350、175、87.5 mg/kg 1周，可顯著增加基礎(chǔ)及腦缺血后缺血局部腦血流量。腦必通膠囊的組成成分紅景天、三七、川芎和銀杏葉具有改善血液流變學(xué)指標(biāo)及抑制血小板聚集的作用，這些作用可能是腦必通膠囊增加腦血流量的機(jī)制之一。但腦必通膠囊對內(nèi)皮細(xì)胞是否有直接作用?

NO是目前公認(rèn)的一種信息傳遞分子，在腦缺血損傷中具有神經(jīng)保護(hù)和神經(jīng)毒性雙重作用［6］:即在腦缺血早期表現(xiàn)出保護(hù)作用，但NO濃度持續(xù)性增高可導(dǎo)致DNA和線粒體的功能損害，后期表現(xiàn)為神經(jīng)毒性作用［7］。腦缺血早期產(chǎn)生的NO可通過激活鳥苷酸環(huán)化酶使cGMP水平升高，擴(kuò)張腦血管，從而增加缺血區(qū)腦血流，保護(hù)腦組織［6］。由于NO化學(xué)性質(zhì)活潑，不易準(zhǔn)確定量測定，其生物作用又完全依賴于NOS的活性，因而其合成酶一氧化氮合成酶(NOS)成為近年缺血性腦血管疾病研究的熱點(diǎn)。根據(jù)組織來源不同，NOS可分為神經(jīng)元細(xì)胞型 (nNOS)、內(nèi)皮細(xì)胞型 (eNOS)、誘導(dǎo)型 (iNOS)。誘導(dǎo)型NOS(iNOS)［6］，廣泛存在于小膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞、中性細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等多種細(xì)胞中。iNOS是一種非Ca2+依賴性的酶，在生理情況下，iNOS并不表達(dá)，但在病理情況下，一些細(xì)胞可誘導(dǎo)基因轉(zhuǎn)錄，啟動蛋白質(zhì)合成，生成iNOS，故誘導(dǎo)數(shù)小時(shí)后才顯示酶活力，且由于iNOS受DNA轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)，一經(jīng)誘導(dǎo)，長時(shí)間保持酶活力。iNOS基因表達(dá)調(diào)控區(qū)有低氧誘導(dǎo)因子-1(hypoxia inducible factor-1，HIF-1)的結(jié)合位點(diǎn)，HIF-1是缺氧調(diào)節(jié)iNOS基因表達(dá)所必需的［2］，血管內(nèi)皮細(xì)胞缺氧時(shí)iNOS基因表達(dá)增加［2］。

本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用低糖結(jié)合物理性缺氧誘導(dǎo)氧糖剝奪所致內(nèi)皮細(xì)胞損傷模型可模擬腦缺血損傷的具體過程［9］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:HUVEC細(xì)胞氧糖剝奪后早期觀察到iNOS mRNA的上調(diào);亦觀察了HUVEC細(xì)胞氧糖剝奪后，iNOS蛋白的激活及核轉(zhuǎn)位的變化。HUVEC細(xì)胞氧糖剝奪后iNOS蛋白量即開始有所增加，并隨氧糖剝奪時(shí)間推移而逐漸增強(qiáng)，于12 h達(dá)高峰，24 h有所下降［2］。本實(shí)驗(yàn)觀察了預(yù)先給予腦必通膠囊含藥血清，HUVEC細(xì)胞氧糖剝奪后iNOS的表達(dá)變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，腦必通膠囊含藥血清可顯著上調(diào)iNOS mRNA表達(dá);增加HUVEC細(xì)胞氧糖剝奪后iNOS的蛋白水平［2，11］。結(jié)果提示腦必通膠囊增加大鼠局部腦血流量可能與其增加內(nèi)皮細(xì)胞iNOS的表達(dá)，從而擴(kuò)張腦血管有關(guān)［11］。

本課題組最近的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明 (待發(fā)表):腦必通膠囊對腦缺血的保護(hù)作用與其激活內(nèi)皮細(xì)胞HIF-1信號通路有關(guān)［12］。大量研究表明低氧環(huán)境下引起HIF-1α的表達(dá)，HIF-1α與其靶基因中的低氧反應(yīng)元件 (HRE)結(jié)合，介導(dǎo)缺氧反應(yīng)，并產(chǎn)生明顯的細(xì)胞保護(hù)作用［13］，從而調(diào)節(jié)血管舒縮反應(yīng)，增加缺血區(qū)腦血流，改善局部血液供應(yīng)，使缺氧的組織細(xì)胞保持氧穩(wěn)定，減輕缺血性腦損傷，發(fā)揮明顯的腦保護(hù)作用［13］。iNOS 是HIF-1α 的主要靶基因之一［3，14］，因此推測腦必通膠囊可能通過激活內(nèi)皮細(xì)胞HIF-1α，從而增加內(nèi)皮細(xì)胞iNOS的表達(dá)。

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