大孔吸附樹脂分離純化知母皂苷A3的研究

李志雄， 孫兆林， 陳明蒼， 徐德生*， 吳 斌*

(1．上海中醫(yī)藥大學，上海201203;2．中國科學院上海藥物研究所，上海201203)

知母是一種常用中藥，具有清熱瀉火，生津潤燥的功效，所含知母皂苷、多糖等成分是主要活性成分［1-9］，知母皂苷A3(結構式見圖1)是知母皂苷中的主要成分之一。黃成鋼等申請的專利表明，經藥理試驗知母皂苷A3可降低血糖和治療Ⅱ型糖尿病，效果良好［10］;韓昌均等申請的專利也表明，知母皂苷A3在預防或治療Ⅱ型糖尿病的效果優(yōu)異而在預防Ⅰ型糖尿病上效果較差［11］;李素燕等研究表明知母皂苷 A3體內給藥具有抗血栓的作用［12］?？梢娭冈碥誂3有較好的應用前景。當前有應用大孔吸附樹脂來精制知母總皂苷的研究［13-14］，但知母皂苷A3未見用大孔吸附樹脂來精制的報道，現(xiàn)多采用硅膠層析柱來分離，需要反復硅膠層析，并且得率低，操作煩瑣，周期長。大孔吸附樹脂具有理化性質穩(wěn)定、吸附選擇性獨特，吸附效率高、不受無機鹽存在的影響、易再生等優(yōu)點，且制備的量較大，有機溶劑可以回收再利用，節(jié)約成本，保護環(huán)境。本實驗篩選了8種大孔樹脂，最后選定AB-8型用于分離純化知母皂苷A3，采用HPLC法測定成品的含有量，結果3批提取物中知母皂苷A3的質量分數(shù)均達到了90%以上。該方法制備周期縮短，制備的量較大。

圖1 知母皂苷A3結構式

1 儀器與材料

Waters 600高效液相色譜儀，Alltech 500蒸發(fā)光散射檢測器，XS105型電子分析天平 (Max 140 g d=0.01 mg，METTLER TOLEDO)，SHZ-B水浴恒溫振蕩器 (上海躍進醫(yī)療器械廠)，玻璃色譜柱 (30 mm×400 mm)，大孔吸附樹脂 (天津市海光化工有限公司，天津市南開大學化工廠)。

知母購自上?？禈蛩帢I(yè)有限公司，經上海藥物研究所沈金貴老師鑒定為百合科植物知母Anemarrhena asphodeloides Bge.的干燥根莖。知母皂苷A3對照品為上海藥物研究所自制，純度為98.5%。

2 方法與結果

2.1 TLC檢識知母皂苷A3 吸附劑:硅膠G;展開劑:正丁醇-乙酸乙酯-水 (4∶1∶5)的下層液;顯色劑:10%磷鉬酸的乙醇溶液，100℃顯色清晰;對照品:知母皂苷A3對照品自制 (純度為98.5%)。

2.2 HPLC測定知母皂苷A3 參考相關文獻 ［15］及實驗室具體情況，采用如下色譜條件:RP C18色譜柱 (3.9 mm×150 mm，5μm);柱溫20℃;流動相:水-乙腈 (55∶45)，體積流量1.0 mL/min;漂移管溫度108℃;氣體體積流量2.92 L/min。供試品溶液的制備:取樣品適量加甲醇超聲溶解，0.45μm微孔濾膜濾過。樣品溶液的測定:精密吸取對照品溶液10μL、20μL，供試品溶液10μL，進樣，測定，以外標兩點法對數(shù)方程計算。

2.3 上柱液的制備 用乙醇提取知母藥材，回收乙醇，濃縮，使每1 mL相當于3 g藥材，再加適量水，靜置沉降24 h，離心分離。沉淀用少量甲醇溶解，用TLC檢識知母皂苷A3，結果沉淀中檢測不到知母皂苷A3，表明水沉能除去雜質而目標成分沒有損失。將上清液用水飽和的正丁醇提取3次 (此時水液中基本無知母皂苷A3)，合并正丁醇液，用0.1 mol/L NaOH溶液洗滌2次，棄去堿液，回收正丁醇，殘渣用水溶解，每1 mL相當于3 g藥材 (知母皂苷A3的質量濃度為3.999 mg/mL)，備用。

2.4 樹脂型號的選擇 取上述經過水沉、萃取除雜的上清液175 mL，8份，分別加入50 g(濕質量)已處理好的8種不同的樹脂中，置具塞錐形瓶中，于SHZ-B型水浴恒溫振蕩器中振蕩24 h(25℃)，濾出大孔樹脂，濾液量取體積，測定知母皂苷A3的量，計算每種樹脂的吸附量。濾出的大孔樹脂裝于色譜柱中，用足量乙醇洗脫，TLC檢測至洗脫液中無知母皂苷A3，合并洗脫液后測定知母皂苷A3的量，以求各種不同型號樹脂的飽和吸附量以及解吸率，選擇吸附量大以及解吸效果好的的樹脂。結果見表1。

表1 不同樹脂對知母皂苷A3的吸附量 (n=3)

結果表明，AB-8樹脂對知母皂苷A3的吸附量最大，最大吸附量為13.17 mg/g樹脂，并且解吸率較高。故選用AB-8樹脂來分離知母皂苷A3。

2.5 洗脫溶劑洗脫能力的考察 取經水沉、萃取除雜的上清液200 mL(C=3.999 mg/mL)，加入酸堿已處理好的AB-8大孔樹脂柱中 (樹脂柱床體積160 mL)，以0.5 BV/h的吸附流速吸附后，分別用240 mL(1.5 BV)①水、②20%乙醇、③30%乙醇、④40%乙醇、⑤50%乙醇、⑥60%乙醇、⑦70%乙醇、⑧80%乙醇、⑨90%乙醇洗脫，洗脫速度為1.5 BV/h，分別收集洗脫液，用HPLC法測定每份中知母皂苷A3的量，并用TLC法檢識每個流份中的各類知母皂苷成分。結果見表2。

表2 洗脫劑含乙醇量對知母皂苷A3的影響 (n=3)

以上結果表明，水對知母皂苷A3無洗脫作用，TLC檢識也無知母皂苷A3和其它皂苷，故可用水除去一部分雜質。HPLC測定結果表明20%、30%、40%乙醇對知母皂苷A3的洗脫能力不大，但TLC可以檢識到大量的其它知母皂苷。HPLC測定結果表明70%乙醇對知母皂苷A3有較強的洗脫能力，且TLC只能檢識到少量的其它知母皂苷。因此，在分離知母皂苷A3時，先用水洗脫，以除去糖類雜質，棄去水溶液;再用40%乙醇洗脫，以除去其它一些知母皂苷，收集40%乙醇洗脫液;再用70%乙醇洗脫，將知母皂苷A3洗脫下來，收集70%乙醇洗脫液，主要含有知母皂苷A3。

2.6 洗脫溶劑用量的考察 取經水沉、萃取除雜的上清液200 mL(C=3.999 mg/mL)，加入75 g已處理好的AB-8大孔樹脂柱中 (樹脂柱床體積160 mL)，以0.5 BV/h的吸附流速吸附后，用8 BV水洗到洗脫液無色，4 BV 40%乙醇洗脫，4 BV 70%乙醇洗脫，4 BV 90%乙醇洗脫，測定3種不同洗脫液中的知母皂苷A3的量，結果如表3。

結果表明，4 BV 40%乙醇洗脫的知母皂苷A3的量較少，而4 BV 70%乙醇能將94.8%的知母皂苷A3從樹脂上洗脫下來。

2.7 知母皂苷A3的精制 70%乙醇洗脫液中主要含有知母皂苷A3。將70%乙醇洗脫液回收乙醇，并濃縮至適當體積，即有知母皂苷A3析出，離心分離出沉淀，以低濃度乙醇 (20%)溶解，再上已處理好的AB-8大孔吸附樹脂柱，吸附，以適量40%乙醇洗脫，再以70%乙醇洗脫，收集70%乙醇洗脫液，回收乙醇，并濃縮至適當體積，即有知母皂苷A3析出，離心分離，質量分數(shù)可達到90%以上，見圖 2、圖 3。3批質量分數(shù)結果分別為 95.36%、94.23%、93.28%。

圖3 第1批知母皂苷A3色譜圖

3 討論

3.1 大孔吸附樹脂分離技術在中藥的提取分離中已經被廣泛應用，是一種成熟的技術，多用于分離有效部位如總黃酮、總皂苷、總生物堿等，其吸附分離效果好，易于實現(xiàn)大生產。但大孔吸附樹脂用于提取分離單一有效成分的應用報道尚不多見。本實驗篩選出AB-8型大孔吸附樹脂，采用較簡單的分離純化步驟結合知母皂苷A3在水中溶解度不大容易析出的特點，即可使知母皂苷A3的質量分數(shù)達到90%以上，具有制備周期短、適于大生產的優(yōu)點，避免了用硅膠柱層析等方法使用大量混合有機溶劑、步驟多、產量小、不易實現(xiàn)批量生產的缺點。

3.2 上柱前藥液采用水沉、萃取的工藝，可除去大部分雜質，使知母皂苷A3得到富集，除去黃酮類等成分的干擾，減輕雜質對樹脂的污染，增強樹脂對知母皂苷A3吸附的選擇性，延長樹脂的使用壽命。

3.3 應用大孔樹脂來分離純化知母皂苷A3，平均得率為0.11%，知母皂苷A3轉移率為70.1%。

3.4 成品中知母皂苷A3的質量分數(shù)達到了90%以上，可研究開發(fā)成有效成分明確、劑量小、起效快、易于質量控制的現(xiàn)代中藥制劑。

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