HPLC法測定腎茶中熊果酸與齊墩果酸

藍(lán)曉玉

(廣西柳州食品藥品檢驗(yàn)所，廣西柳州 545006)

腎茶為唇形科植物腎茶Clerodendron spicatusThunb.的全草，又名貓須草、貓須公。分布于福建、臺(tái)灣、海南、廣西、云南西雙版納等地;味甘、微苦，性涼。化學(xué)成分為三萜類、甾醇類、黃酮類、揮發(fā)油及其他成分。三萜類的熊果酸與齊墩果酸是主要活性成分，具清熱利濕，通淋排石作用［1-2］，民間多用于治急性或慢性腎炎、膀胱炎、尿路結(jié)石等［3-9］。目前采用HPLC法對腎茶藥材中活性成分熊果酸與齊墩果酸的定量方法未見文獻(xiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)建立了HPLC法同時(shí)測定該藥中熊果酸與齊墩果酸的量，結(jié)果表明該方法簡便、快捷、準(zhǔn)確，可為該藥材的質(zhì)量控制提供參考。

1 儀器與試藥

島津LC—20AT高效液相色譜儀，紫外可見波長檢測器;島津UV—2550紫外可見分光光度計(jì);梅特勒XS205電子分析天平。

腎茶藥材為自采或購買，所有樣品經(jīng)本所李玲副主任中藥師鑒定，均為唇形科植物腎茶Clerodendron spicatusThunb.正品。熊果酸對照品 (批號(hào)110742-200516)、齊墩果酸對照品 (批號(hào)110709-200304)購自中國藥品生物制品檢定所。甲醇、乙腈均為色譜純，美國Fisher公司;超純水為實(shí)驗(yàn)室自制。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 ZORBAX SB-Aq C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，柱溫35 ℃;甲醇-乙腈-0.05%醋酸銨溶液 (45∶30∶25)為流動(dòng)相，體積流量1.0 mL/min;檢測波長215 nm;進(jìn)樣量10 μL。

2.2 對照品混合溶液的制備 分別精密稱取熊果酸對照品10.29 mg與齊墩果酸對照品10.19 mg，置同一25 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容，搖勻，得熊果酸與齊墩果酸對照品混合貯備液。

2.3 供試品溶液的制備 精密稱取腎茶藥材粉末(編號(hào)SS2)(過3號(hào)篩)0.5 g，加20 mL乙醇浸泡過夜，超聲 (50 Hz，300 W)提取30 min，過濾，濾渣加入乙醇20 mL，重復(fù)提取一次，用少量乙醇洗滌濾渣及濾紙，合并濾液，蒸干，用甲醇溶解并定容至5 mL，搖勻，即得。

2.4 線性關(guān)系試驗(yàn) 精密量取2.2項(xiàng)下對照品混合貯備液2、1、0.5、0.25、0.125 mL，分別置于2 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得到不同質(zhì)量濃度的對照品混合溶液。精密吸取不同質(zhì)量濃度的對照品混合溶液各10 μL，按上述色譜條件，分別注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖，測定峰面積，以色譜峰面積為Y縱坐標(biāo)，熊果酸與齊墩果酸的質(zhì)量濃度為X橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸分析，得熊果酸和齊墩果酸回歸方程分別為Y=340 119X－15 068(r=1.000 0)，Y=337 469X－5 611(r=1.000 0)，線性范圍分別為0.26～4.1 μg與0.25 ～4.1 μg。

2.5 精密度試驗(yàn) 精密取對照品混合溶液10 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，分別測定峰面積值，計(jì)算出熊果酸與齊墩果酸的RSD分別為1.8%和1.4%，表明儀器性能良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，分別于0、2、4、8、16 h進(jìn)樣測定，其RSD分別為2.0%和1.7%，表明該供試品溶液穩(wěn)定性良好。

2.7 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 精密量取供試品溶液與對照品混合溶液各10 μL，按上述色譜條件，分別注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖，結(jié)果見圖1，熊果酸與齊墩果酸峰達(dá)到基線分離，分離度大于1.5，二者理論塔板數(shù)大于3 000。

圖1 溶劑空白 (A)，對照品 (B)和供試品 (C)色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of blank solvent(A)，reference substances(B)and sample(C)

2.8 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取同一樣品6份，按2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)色譜條件進(jìn)行測定，結(jié)果樣品中熊果酸與齊墩果酸量的均值為0.097% (RSD為1.2%)和0.059% (RSD為1.4%)。

2.9 加樣回收試驗(yàn) 精密稱取已測知熊果酸與齊墩果酸劑量的樣品 (編號(hào)SS2)約0.25 g共6份，分別加入205.80 μg/mL熊果酸1.25 mL和203.80 μg/mL齊墩果酸0.70 mL，按供試品溶液的制備方法及色譜條件項(xiàng)下操作，計(jì)算回收率，結(jié)果腎茶藥材中熊果酸與齊墩果酸的平均回收率 (n=6)96.85%(RSD為0.7%)和98.40% (RSD為1.0%)。結(jié)果見表1。

2.10 樣品測定 取不同產(chǎn)地的腎茶藥材0.5 g，按2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng) 色譜條件進(jìn)行測定，按外標(biāo)法分別計(jì)算樣品中熊果酸與齊墩果酸的量，結(jié)果見表2。

3 討論

參照文獻(xiàn)［10-11］分別嘗試用甲醇索氏提取、先用乙醚索氏提取除去雜質(zhì)再用甲醇索氏提取、25%鹽酸-甲醇 (1∶4)回流提取、乙醇超聲提取等方式，結(jié)果發(fā)現(xiàn)乙醇超聲提取效果較好，且易操作。

表1 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果Tab.1 Results of recovery tests

經(jīng)查閱文獻(xiàn)，熊果酸與齊墩果酸的測定有采用蒸發(fā)光散射檢測器也有采用紫外檢測器的，考慮到相對于蒸發(fā)光散射檢測器，紫外檢測器的專屬性及靈敏度更高，故本方法采用紫外檢測器?？疾煨芄崤c齊墩果酸的紫外吸收圖譜，二者在200～300 nm范圍內(nèi)均無明顯最大吸收，參考文獻(xiàn)選定215 nm為測定波長。在流動(dòng)相考察中，選用甲醇-水系統(tǒng)時(shí)，峰形差，分離不好;選擇甲醇-0.5%醋酸銨、甲醇-0.2%磷酸、甲醇-0.2%醋酸系統(tǒng)時(shí)基線波動(dòng)嚴(yán)重，噪聲過大;選用甲醇-0.05%醋酸銨系統(tǒng)時(shí)，峰高較低，峰形不夠尖銳;選擇乙腈-0.05%醋酸銨系統(tǒng)時(shí)，峰形雖有明顯改善，但分離度達(dá)不到要求，采用甲醇-乙腈-0.05%醋酸銨(45∶30∶25)三相系統(tǒng)作為流動(dòng)相時(shí)，分離度及峰形均能滿足實(shí)驗(yàn)要求。

表2 樣品測定結(jié)果 (n=5)Tab.2 Determination results(n=5)

有文獻(xiàn)報(bào)道了用RP-HPLC法測定腎茶藥材中迷迭香酸［12-13］、用薄層掃描法測定腎茶中熊果酸［14-15］，本實(shí)驗(yàn)建立了目前在藥品質(zhì)量控制中運(yùn)用最廣泛的HPLC法同時(shí)測定腎茶藥材中主要活性成分熊果酸與齊墩果酸，結(jié)果表明該方法簡便、快捷、準(zhǔn)確，可為該藥材的質(zhì)量控制提供參考。

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