五脈綠絨蒿總黃酮和總生物堿抗大鼠肝纖維化

王志旺， 邵 晶， 郭 玫*， 王瑞瓊， 任 遠

(1.甘肅中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系，甘肅 蘭州 730000;2.甘肅省中藥藥理與毒理學(xué)重點實驗室，甘肅 蘭州 730000;3.甘肅省高校中 (藏)藥化學(xué)與質(zhì)量研究省級重點實驗室，甘肅蘭州 730000)

罌粟科綠絨蒿屬植物五脈綠絨蒿Meconopsis quintuplinerviaRegel在藏醫(yī)臨床上可用于治療肝炎、肝的熱癥等病癥［1］;前期研究顯示五脈綠絨蒿及其有效部位 (如總黃酮)具有明顯的鎮(zhèn)痛、抗炎、體外抗氧化等作用［2-3］;本次實驗設(shè)計了五脈綠絨蒿的各提取物 (醇提物、總黃酮與總生物堿及其混合物)對肝纖維化的影響，探討五脈綠絨蒿抗大鼠肝纖維化的有效部位及其作用機制，為臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。五脈綠絨蒿保肝降酶的活性已有文章報道，現(xiàn)將其抗肝纖維化的實驗結(jié)果匯報如下。

1 材料

1.1 動物 SPF級Wistar大鼠，體質(zhì)量 (200±20)g，由甘肅中醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供，動物生產(chǎn)許可證SCXK(甘)2004-0006，甘肅中醫(yī)學(xué)院實驗動物中心飼養(yǎng)并進行實驗。

1.2 藥物 五脈綠絨蒿全草，經(jīng)甘肅省臨洮農(nóng)校盧通寧高級講師鑒定。秋水仙堿 (對照藥)，西雙版納版納藥業(yè)責任有限公司生產(chǎn)，批號:20110711。

1.3 試劑 四氯化碳 (CCl4)，廣東汕頭市西隴化工廠生產(chǎn);透明質(zhì)酸、Ⅲ型前膠原、Ⅳ型膠原及板層素放免試劑盒，北京北方生物技術(shù)研究所產(chǎn)品;羥脯氨酸 (Hyp)試劑盒，南京建成生物工研究所產(chǎn)品。

2 方法

2.1 五脈綠絨蒿各受試藥的制備 取藥材粗粉適量，用90%乙醇回流提取，回收乙醇即得乙醇提取物 (醇提物)。將醇提物溶于蒸餾水中，用石油醚萃取除雜質(zhì)后用1 mol/L HCl溶解，調(diào)pH值至2～3，過濾，濾液中主要含有生物堿，殘留物即為黃酮類粗品。將黃酮粗品用1 mol/L NaOH溶解，調(diào)pH值至9～10，過濾，堿水層再用1 mol/L HCl調(diào)pH值至2～3，用乙酸乙酯萃取即得五脈綠絨蒿總黃酮。將上述含有生物堿的酸性濾液用濃氨水調(diào)pH值9～10，用三氨甲烷萃取即得五脈綠絨蒿總生物堿。總黃酮與總生物堿按提取率混合即得總黃酮和總生物堿提取物。分別精密稱取五脈綠絨各提取部位適量，加入1.5%的吐溫－80，制備各受試藥的乳劑，另制備1.5%吐溫－80對照液，冷藏備用。

2.2 分組、造模與給藥 取Wistar大鼠按性別體質(zhì)量分層隨機分為8組，即正常對照組、模型對照組、秋水仙堿組 (0.1 mg/kg)、五脈綠絨蒿醇提物組 (1.803 g/kg)、五脈綠絨蒿黃酮和生物堿組(0.283 g/kg)、五脈綠絨蒿總黃酮高、低劑量組(0.141 g/kg、0.047 g/kg)、五脈綠絨蒿總生物堿組 (0.142 g/kg)。參照相關(guān)實驗方法［4-5］，采用CCl4復(fù)合因素復(fù)制肝纖維化造模:給大鼠皮下注射40%CC14橄欖油3.0 mL/kg(首劑量5.0 mL/kg)，2次/周，連續(xù)6周;造模第3周與4周給予高脂低蛋白質(zhì)飼料，整個造模期間飲用20%乙醇。正常對照組皮下注射等量橄欖油，普通飼養(yǎng)。各組大鼠從造模起每天按上述劑量灌胃各藥物乳劑15 mL/kg，其中正常對照組與模型對照組給予對照液。

2.3 指標觀測與方法 實驗過程中模型對照組、秋水仙堿組與黃酮高劑量組各有一只大鼠死亡。實驗第6周，大鼠末次給藥24 h、禁食12 h后，用2%戊巴比妥麻醉，股靜脈采血，分離血清并檢測肝纖維化指標;摘取肝臟，觀察外形、色澤、質(zhì)地，在肝右葉固定位置取肝組織，行HE染色，觀察病理學(xué)變化，并進行半定量分析［6］;同時取肝組織適量制成肝干粉，測定肝組織羥脯氨酸水平，按下式計算肝膠原蛋白水平。

膠原蛋白(μg/mg肝粉)=羥脯氨酸÷13.4%

3 結(jié)果

3.1 五脈綠絨蒿對肝纖維化大鼠體質(zhì)量及肝指數(shù)的影響 實驗結(jié)束時，與正常對照組比較，模型對照組大鼠的體質(zhì)量顯著降低、肝指數(shù)明顯升高(P＜0.01);與模型對照組比較，五脈綠絨蒿醇提物組、黃堿組及黃酮高劑量組大鼠的體質(zhì)量有所提高，五脈綠絨蒿提取物 (除生物堿組外)對大鼠肝指數(shù)有不同程度的降低作用。結(jié)果見表1。

3.2 五脈綠絨蒿對肝纖維化大鼠肝組織Hyp及膠原蛋白水平的影響 由表2可以看出，與正常對照組比較，模型對照組大鼠肝組織Hyp及膠原蛋白水平明顯增加 (P＜0.01);與模型對照組比較，五脈綠絨蒿各提取物 (除生物堿外)能明顯降低Hyp及膠原蛋白的水平。

3.3 五脈綠絨蒿對肝纖維化大鼠血清肝纖維化指標的影響 表3結(jié)果顯示，與正常對照組比較，模型組大鼠肝纖維化指標明顯升高 (P＜0.01);與模型對照組比較，五脈綠絨蒿提取物 (除生物堿組)可不同程度地降低血清透明質(zhì)酸、Ⅲ型前膠原、Ⅳ型膠原及板層素水平。

表1 五脈綠絨蒿對肝纖維化大鼠體質(zhì)量及肝指數(shù)的影響(±s)Tab.1 Effect of Meconopsis quintuplinervia on body weight and liver index of the hepatic fibrosis in rats(±s)

表1 五脈綠絨蒿對肝纖維化大鼠體質(zhì)量及肝指數(shù)的影響(±s)Tab.1 Effect of Meconopsis quintuplinervia on body weight and liver index of the hepatic fibrosis in rats(±s)

注:與模型對照組比較，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01。

組 別 動物/只 體質(zhì)量/g第1天 第42天 肝指數(shù)/(mg·g－1)正常對照組 11 218.64±12.40 295.5±53.3＊＊ 28.46±4.05＊＊11 211.00±15.82 218.9±32.2 39.97±7.38模型對照組 10 216.27±20.86 223.5±31.2 43.48±6.57秋水仙堿組 10 211.18±16.69 230.1±41.1 37.17±5.61*醇提物組 11 216.55±16.32 262.5±38.1* 33.86±4.99＊＊黃酮和生物堿組 11 216.27±16.04 259.4±42.8* 34.20±5.35＊＊黃酮高劑量組 10 209.82±11.98 255.5±29.1* 34.57±5.42＊＊黃酮低劑量組 11 208.18±10.85 235.4±30.9 37.79±5.87*生物堿組

表2 五脈綠絨蒿對肝纖維化大鼠肝Hyp及膠原蛋白水平的影響(±s)Tab.2 Effect of Meconopsis quintuplinervia on Hyp and collagen fiber in hepatic tissue of the hepatic fibrosis in rats(±s)

表2 五脈綠絨蒿對肝纖維化大鼠肝Hyp及膠原蛋白水平的影響(±s)Tab.2 Effect of Meconopsis quintuplinervia on Hyp and collagen fiber in hepatic tissue of the hepatic fibrosis in rats(±s)

注:與模型對照組比較，*P＜0.05，＊＊P＜0.01;與黃酮低劑量組比較，#P＜0.05。

組 別 動物/只 劑量原生藥/(g·kg－1) 提取物/(g·kg－1) Hyp/(μg·mg－1) 膠原蛋白/(μg·mg－1)正常對照組 11 － 0.684±0.183＊＊ 5.105±1.363＊＊模型對照組 10 － 1.215±0.295 9.065±2.203秋水仙堿組 10 0.1 mg/kg 0.652±0.194＊＊ 4.865±1.446＊＊醇提物組 11 15 1.803 0.713±0.185＊＊ 5.320±1.377＊＊黃酮和生物堿組 11 15 0.283 0.735±0.194＊＊ 5.482±1.451＊＊黃酮高劑量組 10 15 0.141 0.745 ±0.192＊＊# 5.562 ±1.434＊＊#黃酮低劑量組 11 5 0.047 0.979±0.202* 7.308±1.506*生物堿組11 15 0.142 1.147±0.248 8.561±1.853

表3 五脈綠絨蒿對大鼠肝纖維化指標的影響(±s)Tab.3 Effect of Meconopsis quintuplinervia on the contents of liver fibrosis of the hepatic fibrosis in rats(±s)

表3 五脈綠絨蒿對大鼠肝纖維化指標的影響(±s)Tab.3 Effect of Meconopsis quintuplinervia on the contents of liver fibrosis of the hepatic fibrosis in rats(±s)

注:與模型對照組比較，*P＜0.05，＊＊P＜0.01;與黃酮低劑量組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

組 別 動物/只 透明質(zhì)酸/(μg·L－1) Ⅲ型前膠原/(μg·L－1) Ⅳ型膠原/(μg·L－1) 板層素/(μg·L－1)正常對照組 11 75.07±9.94＊＊ 61.04±8.18＊＊ 64.71±11.57＊＊ 94.74±12.19＊＊模型對照組 10 156.51±18.31 101.61±15.34 94.63±15.79 164.21±19.07秋水仙堿組 10 96.16±16.80＊＊ 75.34±9.46＊＊ 69.83±12.43＊＊ 116.35±17.06＊＊醇提物組 11 102.25±17.82＊＊ 83.06±10.12＊＊ 71.59±12.87＊＊ 109.53±15.46＊＊黃酮和生物堿組 11 106.84±18.84＊＊ 86.61±10.44* 72.68±12.96＊＊ 110.69±16.36＊＊黃酮高劑量組 10 109.86±19.99＊＊ 83.42±10.50＊＊ 70.22±12.83＊＊# 113.38±16.37＊＊##黃酮低劑量組 11 127.46±21.47＊＊ 88.83±10.68* 83.32±13.95 147.37±17.65*生物堿組 11 136.67±22.52*91.68±12.31 88.71±14.07 154.69±18.25

3.4 五脈綠絨蒿對大鼠肝組織纖維化病理變化的影響 正常對照組大鼠肝臟呈紫紅色，表面光滑均勻;模型對照組大鼠肝臟表面發(fā)暗并有暗黃色顆粒，質(zhì)地硬脆;五脈綠絨蒿各提取物組動物肝臟病理變化有一定改善。在顯微鏡下，正常對照組肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝細胞排列規(guī)則 (圖1-A);模型對照組肝小葉結(jié)構(gòu)破壞，肝細胞排列紊亂，大量膠原沉積 (圖1-B);各給藥組 (除生物堿組)雖可見纖維形成的現(xiàn)象，但程度較輕 (圖1-C、1-D、1-E、1-F、1-G)。對肝臟病理變化進行半定量分析，表4結(jié)果顯示五脈綠絨蒿醇提物、黃堿組及總黃酮能明顯減輕大鼠肝纖維變 (P＜0.05、0.01)。

4 討論

肝纖維化是肝臟組織對慢性損傷的修復(fù)反應(yīng)，是大多數(shù)慢性肝病共同的病理特征，目前多數(shù)學(xué)者認為肝纖維化進程可逆，故防治肝纖維化是肝病防治的重要環(huán)節(jié)［7］。藏藥五脈綠絨蒿 (五脈綠絨蒿)在藏醫(yī)典籍中記載可用于治療肝炎、膽囊炎、肺炎［8］，臨床上由五脈綠絨蒿等藥物組成的復(fù)方用于治療慢性肝炎取得了較好的療效［9-10］。本課題組在五脈綠絨蒿抗炎、抗氧化有效的基礎(chǔ)上，觀察五脈綠絨蒿不同提取部位抗肝纖維化的作用。研究結(jié)果顯示，五脈綠絨蒿醇提物、總黃酮及其與總生物堿的混合物可不同程度地促進大鼠體質(zhì)量的增加，降低肝指數(shù)與血清肝酶水平 (該內(nèi)容另有文章報道)，減輕大鼠肝纖維病理變化。

圖1 五脈綠絨蒿對肝纖維化大鼠肝臟病理的影響 (HE染色，×20)Fig.1 Effect of Meconopsis quintuplinervia on liver tissue histological changes in rats(HE staining， ×20)

表4 五脈綠絨蒿對大鼠肝臟膠原纖維增生的影響(±s)Tab.4 Effect of Meconopsis quintuplinervia on comparison of liver collagen fibers hyperplasia in rats(±s)

表4 五脈綠絨蒿對大鼠肝臟膠原纖維增生的影響(±s)Tab.4 Effect of Meconopsis quintuplinervia on comparison of liver collagen fibers hyperplasia in rats(±s)

注:與模型對照組比較，*P＜0.05，＊＊P＜0.01;與黃酮低劑量組比較，#P＜0.05。

組 別 動物/只 肝臟纖維增生程度分期/例0ⅠⅡⅢⅣ肝纖維化計分/分正常對照組 11 11 0 0 0 0 0.91±0.38＊＊模型對照組 10 0 0 4 5 1 5.14±1.12秋水仙堿組 10 0 7 2 1 0 2.86 ±1.00＊＊醇提物組 11 1 6 4 0 0 2.77 ±0.85＊＊黃酮和生物堿組 11 1 6 4 0 0 2.91±0.94＊＊黃酮高劑量組 10 1 7 1 1 0 2.82 ±0.90＊＊#黃酮低劑量組 11 0 5 4 2 0 3.91±1.09*生物堿組11 0 3 4 4 0 4.27±1.13

在肝纖維化過程中，肝細胞外膠原組織明顯增多［11］，實驗結(jié)果顯示，五脈綠絨蒿醇提物、總黃酮及其與總生物堿的混合物能使肝纖維化大鼠肝組織中羥脯氨酸與膠原蛋白水平明顯降低，顯示出明顯的抗肝纖維化作用。血清透明質(zhì)酸、Ⅲ型前膠原、Ⅳ型膠原及板層素是反映肝纖維化非常重要的指標，透明質(zhì)酸是細胞外基質(zhì)的主要組成成分，肝纖維化早期血液中透明質(zhì)酸即顯著增加，是反應(yīng)肝纖維化最有價值的血清標志物;板層素是一種非膠原結(jié)構(gòu)糖蛋白，在肝內(nèi)與Ⅳ型膠原共同分布，其大量沉積可引起肝竇毛細血管化及匯管區(qū)纖維化，血清板層素是反應(yīng)基底膠原更新的指標;血清Ⅲ型前膠原水平的升高則提示肝纖維化處于活動期［12］。本次實驗結(jié)果提示五脈綠絨蒿醇提物及其總黃酮能顯著減低血清透明質(zhì)酸、Ⅲ型前膠原、Ⅳ型膠原及板層素水平。

實驗過程中，五脈綠絨蒿總生物堿抗肝纖維化的作用不明顯;同時醇提物、總黃酮及其與總生物堿的混合物抗肝纖維化作用之間沒有統(tǒng)計學(xué)意義，提示總黃酮是五脈綠絨蒿抗肝纖維化的主要有效部位，這與本研究組前期研究，即五脈綠絨蒿總黃酮具有抗炎、抗氧化的作用相一致。

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